MIF engagemang i AML (MIFAML)

Studien syftar till att studera MIFs inblandning i AML för vuxna.

1. BESKRIVNING AV ELEMENTET ELLER ELEMENTEN UNDER UNDERSÖKNING 1.1. Mätning av MIF-koncentrationer Plasma- och BM-supernatant från patienter och kontroller (100 åldersmatchade kontroller för blod och BM-plasma, tillgängliga på Tours Hospital, ClinicalTrials.gov #NCT02789839) kommer att analyseras med ELISA. BM-supernatanter kommer att erhållas efter en 2-stegs centrifugeringsprocedur: 1 mL färskt BM från AML-patienter eller kontroll-BM kommer att centrifugeras vid 540 g under 5 minuter för att återvinna livsdugliga celler i pelleten (för cytometriska och expressionsstudier); supernatanten kommer att centrifugeras vid 1000 g/15 min/4°C för att framställa plasman. MIF-koncentrationer i BM och blodplasma kommer systematiskt att jämföras. Eftersom MIF-koncentrationer kan påverkas av olika faktorer, inklusive inflammation, leukocytos och monocytos, kommer blodcellstal och plasma C-reaktivt proteinnivåer att mätas och tas med i beräkningen vid tolkningen av data.

1.2. Mätning av MIF-, CD74- och CXCR4-uttryck Hematopoetiska stamceller, progenitorceller och blaster från AML-patienter kommer att sorteras efter uttrycket av CD34, CD38, CD90, CD45-RA, IL-3R-antigener, med hänsyn tagen till den initiala immunfenotypen av sjukdomen. Hematopoetiska stamceller och progenitorceller från kontroll-BM-prover kommer att sorteras på liknande sätt. MIF, CD74 och CXCR4 RNA-uttryck kommer att studeras med kvantitativ RT-PCR i sorterade cellsubpopulationer. Ytuttrycket av CXCR4 och anti-CD74 samt intracellulär CD74 kommer att studeras genom multiparametriskt flöde med cytometri.

1.3. Analys av MIF, CD74, CXCR4 uttryck och MIF koncentrationer vid tidpunkten för fullständig remission.

Analyserna som utförs i a) och b) kommer att upprepas i kompletta remissionsprover hos 30 till 50 utvalda patienter. Patienterna kommer att väljas ut i enlighet med deras svar på behandlingen (bedömning av fullständig remission och normala blodvärden) och till genotypen av deras sjukdom (15-25 patienter med antingen TET2- eller DNMT3A-mutationer vid diagnos kontra 15-25 patienter utan dessa mutationer) . Prover kommer att samlas in efter två kemoterapikurser vid tidpunkten för remissionsutvärdering. När det är möjligt kommer benmärgskontroller av patienter i långvarig remission (> 1 år efter diagnos) att samlas in och studeras. Under tiden kommer NGS-, ddPCR-, FISH- eller RT-PCR-tekniker att användas för att bedöma ihållande eller frånvaro av de initiala AML-lesionerna.

Det förväntas att fullständigt material kommer att erhållas för 80 % av de inkluderade patienterna, vilket gör att målet om 240 patienter kan uppnås på mindre än tre år. Cellrening kan vara ett problem i samband med AML med avvikande immunfenotyp: detta kommer att beaktas genom användning av lämpliga FACS-protokoll. När det gäller fokus på MIF-väg kan det inte utesluta att andra kemokiner/cytokiner eller andra molekyler kan vara involverade i kommunikationen av AML-celler och deras mikromiljö. Således kommer alikvoter av BM och blodplasma att kryokonserveras för att möjliggöra en förfining av vår strategi (till exempel för att utföra cytokinarrayer, ELISA eller MS-analyser som finns tillgängliga på Saint-Antoine Hospital).

1.4. Xenotransplantationsmodell av primär AML i NSG-möss Xenotransplantationsmodeller av primära AML-celler har utvecklats i en kohort av 70 AML där MIF-uttryck kommer att analyseras, den cytogenetiska och molekylära genotypen, och korrelera dessa parametrar till olika engraftande fenotyper.

1.5. MIF-hämning i NSG-möss transplanterade med AML-celler och i NSG-möss transplanterade med TET2-utarmade eller DNMT3A-utarmade navelsträngsblod-HSPC:er. MIF:s roll för leukemiutveckling i NSG-möss xenotransplanterade med primära celler kommer att användas. I dessa experiment kommer primära AML-patientceller från 6 patienter med TET2-mutationer från vår kohort som transplanterar att användas för att generera leukemi. När leukemiutveckling kommer att ses i blod (mellan 8 till 10 veckor), kommer MIF-uttryck att mätas i serum från möss. Möss kommer att randomiseras i tre grupper med 7 möss per grupp: En grupp kommer att behandlas med en kommersiellt tillgänglig MIF-hämmare (ISO-1) och en andra grupp med en anti-MIF-antikropp och en grupp kommer att behandlas av vehikeln i tre veckor (en injektion i veckan). Möss kommer sedan att övervakas för att upptäcka pre-leukemisk engraftment och AML-utveckling med veckovis blodprovtagning och anti-human CD45-färgning.

En modell för xenotransplantation av CD34+-celler från navelsträngsblod transducerade med lentivectors som uttrycker TET2 shRNAs har utvecklats. Dessa konstruerade CD34-positiva celler visade ökat MIF-uttryck och utsöndring och uppvisar förbättrad multilineage NSG-inplantering. Il kommer att testas om hämning av MIF med användning av MIF-hämmare eller anti-MIF-antikropp leder till en korrigering av den förstärkta multilineage-NSG-inplanteringen av TET2-utarmade celler jämfört med kontrollceller. Liknande experiment kommer att utföras med en DNMT3A-utarmad modell med DNMT3A shRNA som för närvarande finns tillgängliga i laboratoriet. Dessutom kommer effekterna av MIF-hämning (inhibitor och antikropp) och rekombinant human MIF att analyseras i NSG-repopulationsanalyser av obearbetade normala CD34+-celler från navelsträngsblod.

1.6. MIF-hämning i NSG-möss transplanterade med celler från patienter i fullständig remission med ihållande klonal hematopoies (DNMT3A / TET2-mutant) Kompletta remissionsprover från sex patienter med ihållande klonal hematopoies i fullständig remission kommer att väljas och behandlas som i a) för att testa om MIF-hämning kan också motverka NSG-repopulation av kvarvarande preleukemiska stamceller.

Det förväntas att MIF-hämning kommer att försämra utvecklingen av AML hos möss. Stabilitet och biverkningar av anti-MIF-antikroppar eller -hämmare kan dock vara ett problem hos behandlade djur. I det här fallet kommer shRNA att användas för att slå ner MIF i AML-celler före injektion till NSG-möss. En annan fråga kan vara behovet av samtidig injektion av MSC vid tidpunkten för xenotransplantation för att öka modellens relevans. Om det behövs kommer normala MSC och AML MSC att samlas in, prepareras och injiceras tillsammans med AML-celler.

1.7. Fullständig karakterisering av uppregleringen av MIF i TET2-utarmade celler Hur TET2 kan påverka genreglering är fortfarande inte helt klarlagt. Nyligen har Cao X:s team visat att förlust av Tet2 resulterade i uppreglering av flera inflammatoriska mediatorer. I denna modell rekryterade Tet2 Hdac2 och undertryckte transkription av Il6 via histondeacetylering. Det har visat sig att TET2 binder den proximala promotorn av MIF-genen som är berikad på CpG-öar i Kasumi-celler. Förlust av TET2 resulterar i MIF-ackumulering i flera leukemimodeller genom EGR1. i) MIF-promotormetylering kommer att analyseras genom sekvensering efter bisulfitbehandling i normala CD34+-celler (20 prover) och cellpopulationer från AML sorterade som i c)(150 prover) ii) EGR1-mRNA-uttryck kommer att analyseras med qRT-PCR i normal och AML pre-leukemiska stamceller för att se om det finns en korrelation med MIF-uttryck som observerats i andra modeller iii) ChIP-PCR-analyser med fokus på MIF-promotor kommer att utföras för EGR1, H3K4me3, H3K27me3 och HDAC2 i kontroll- och AML-patientprover. Om EGR1 inte är involverad i detta system kommer MIF-promotorluciferasanalys att användas för att identifiera transkriptionsfaktorställen som är väsentliga för dess uppreglering i AML-prover och validera målen med ChIP-PCR. Alla dessa tekniker är tillgängliga.

1.8. dubbelriktad kommunikation mellan MSC och AML-celler eller normala HSPC Effekten av MIF-överuttryck i AML-celler kommer att testas på fysiologin hos normala MSC (differentiering, upprätthållande av hematopoiesis, produktion av cytokiner/kemokiner, interaktom). För detta syfte kommer normala primära MSC från vuxen benmärg (redan tillgänglig) att isoleras och expanderas enligt beskrivning (Reinisch A et al, Blood 2015, 125:249-260). Cellerna kommer att förstärkas upp till passage 2 (P2). MSC:er kommer att behandlas med olika koncentrationer av rekombinant MIF under 24 och 48 timmar och proliferationen, produktionen av cytokiner/kemokiner kommer att utvärderas. Eftersom det har rapporterats att MIF stimulerar glykolys, kommer effekterna av MIF också att dechiffreras i den energiska metabolismen av MSC genom att mäta mitokondriell andning och glykolys av MSC (Seahorse XF extracellulär flödesanalysator) och genom att bestämma deras MIF-inducerade metabolism signatur med multiplexerat fingeravtryck med hög genomströmning (Omnilog Biolog). För att modellera effekterna av MIF-överuttryck av AML-celler, kommer att utföra samodlingsexperiment mellan humana primära AML-celler (5 prover) som uttrycker eller inte (shRNA) av MIF. Efter 24 och 48 timmar kommer MSC att sorteras och deras proliferation, cellcykel och differentieringspotential till osteoblaster, adipocyter och kondrocyter kommer att utvärderas. Tidigare studier indikerar att MIF-CXCR4 är en ny axel för MSC-rekrytering till tumörer in vivo.

Sålunda kommer det att studeras om rekombinant MIF kan rekrytera MSC: er genom att använda in vitro transwell-analyser. Effekten av MIF-produktion av AML-celler på MSCs rekrytering kommer att testas med användning av AML-konditionerat medium. AML-celler konstruerade med MIF shRNA kommer att användas i detta sammanhang. Eftersom det inte kan utesluta att MSC också kan bidra till MIF-produktion, kommer mRNA-uttryck att testas av primär normal MSC samodlad med AML-celler.

Det förväntas att rekombinant MIF kommer att ha en inverkan på antingen proliferation, cellcykel, differentieringspotential eller migration av MSC. MIF producerad i BM-mikromiljö kan emellertid också modifiera biologin hos andra populationer av stamcellsnischen inklusive osteoblaster, endotelceller eller makrofager. För att undersöka alternativa celler som MIF kan ha en inverkan på kommer det att testas dess effekter på dessa populationer. MSC kommer att induceras att differentiera till osteoblaster, adipocyter eller kondrocyter. MIF kommer sedan att läggas till för att undersöka proliferation, cellcykel och migration av populationer av intresse. Effekten på osteoblaster och endotelceller kommer att modelleras med hjälp av MG63- respektive Huvec-cellinjer.

1.9. Studiepopulation 1.9.1. Rekrytering av deltagare 300 vuxna patienter (>18) nydiagnostiserade med AML kommer att inkluderas i studien. 85 patienter diagnostiserade sedan november 2015 på Saint-Antoine Hospital kommer retrospektivt att inkluderas i studien. 215 patienter som nyligen diagnostiserats med AML på Saint-Antoine och Tours universitetssjukhus kommer prospektivt att inkluderas [>100 AML patienter per år remitteras till Saint-Antoine sjukhus (>70 patienter per år) och Tours University Hospital för AML (>30 patienter per år) år)].

1.9.2. Deltagaruppföljning

Patientprovsamling:

Endast blod- och benmärgsprover av standardvård kommer att användas i studien:

• Blodprover för biokemi, antal blodkroppar, immunfenotypning, cytogenetik, molekylärbiologiska analyser och tumörbankskryokonservering
• Benmärgsprover för immunfenotypning, cytogenetik, molekylärbiologiska analyser och tumörbankskryokonservering

Tidpunkter:

Endast prover av standardvårdstidpunkt kommer att samlas in:

• Tidpunkt för diagnos (dag 0, Dx-prov)
• Efter den första kemoterapikuren (tidpunkt C1)
• Efter den andra kemoterapikuren (tidpunkt C2)
• Efter den tredje kuren av kemoterapi (tidpunkt C3)

• Vid återfall eller refraktäritet,

  • vid tidpunkten för diagnos av första skov eller refraktäritet (RR1)
  • vid tidpunkten för diagnos av andra skov eller refraktäritet (RR2)
• Långsiktiga remissionskontrollprover 1, 2, 3 år efter diagnos (LTR1, 2, 3)