Участие МИФ в борьбе с отмыванием денег (MIFAML)

Исследование направлено на изучение участия MIF в развитии ОМЛ у взрослых.

1. ОПИСАНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО ЭЛЕМЕНТА ИЛИ ЭЛЕМЕНТОВ 1.1. Измерение концентраций MIF Плазма и супернатант КМ пациентов и контрольной группы (100 контрольных образцов крови и плазмы КМ соответствующего возраста, доступны в больнице Турс, ClinicalTrials.gov #NCT02789839 ) будут проанализированы с помощью ELISA. Супернатанты BM будут получены после двухэтапной процедуры центрифугирования: 1 мл свежего BM от пациентов с ОМЛ или контрольного BM будет центрифугирован при 540 g в течение 5 минут для восстановления жизнеспособных клеток в осадке (для цитометрических исследований и исследований экспрессии); надосадочную жидкость центрифугируют при 1000 g/15 мин/4°C для приготовления плазмы. Концентрации MIF в костном мозге и плазме крови будут систематически сравниваться. Поскольку на концентрации MIF могут влиять различные факторы, включая воспаление, лейкоцитоз и моноцитоз, количество клеток крови и уровень С-реактивного белка в плазме будут измеряться и учитываться при интерпретации данных.

1.2. Измерение экспрессии MIF, CD74 и CXCR4. Гемопоэтические стволовые клетки, клетки-предшественники и бласты от больных ОМЛ будут отсортированы по экспрессии антигенов CD34, CD38, CD90, CD45-RA, IL-3R с учетом исходного иммунофенотипа болезнь. Таким же образом будут отсортированы гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники из контрольных образцов костного мозга. Экспрессию РНК MIF, CD74 и CXCR4 будут изучать с помощью количественной ОТ-ПЦР в субпопуляциях отсортированных клеток. Поверхностная экспрессия CXCR4 и анти-CD74, а также внутриклеточного CD74 будет изучаться многопараметрическим потоком с цитометрией.

1.3. Анализ экспрессии MIF, CD74, CXCR4 и концентрации MIF во время полной ремиссии.

Анализы, выполненные в пунктах а) и б), будут повторены в образцах с полной ремиссией у 30–50 отобранных пациентов. Пациенты будут отобраны в соответствии с их реакцией на терапию (оценка полной ремиссии и нормальные показатели крови) и генотипом их заболевания (15-25 пациентов с мутациями TET2 или DNMT3A на момент постановки диагноза против 15-25 пациентов без этих мутаций). . Образцы будут взяты после двух курсов химиотерапии во время оценки ремиссии. По возможности будут собираться и изучаться контрольные образцы костного мозга пациентов с длительной ремиссией (> 1 года после постановки диагноза). Тем временем методы NGS, ddPCR, FISH или RT-PCR будут использоваться для оценки персистенции или отсутствия начальных поражений ОМЛ.

Ожидается, что полный материал будет получен для 80% включенных пациентов, что позволит достичь цели 240 пациентов менее чем за три года. Очистка клеток может быть проблемой в контексте ОМЛ с аберрантным иммунофенотипом: это будет учитываться при использовании соответствующих протоколов FACS. Что касается фокуса на пути MIF, нельзя исключать, что другие хемокины/цитокины или другие молекулы могут быть вовлечены в коммуникацию клеток ОМЛ и их микроокружения. Таким образом, аликвоты костного мозга и плазмы крови будут подвергнуты криоконсервации, чтобы можно было усовершенствовать нашу стратегию (например, для проведения цитокиновых массивов, ИФА или МС-анализов, которые доступны в больнице Сент-Антуан).

1.4. Модель ксенотрансплантации первичного ОМЛ у мышей NSG Модели ксенотрансплантации клеток первичного ОМЛ были разработаны в когорте из 70 ОМЛ, в которых будет проанализирована экспрессия MIF, цитогенетический и молекулярный генотип, и сопоставлены эти параметры с различными фенотипами приживления.

1.5. Ингибирование MIF у мышей NSG, которым трансплантировали клетки AML, и у мышей NSG, которым трансплантировали HSPC, лишенные TET2 или DNMT3A, будет рассмотрена роль MIF в развитии лейкемии у мышей NSG, которым ксенотрансплантированы первичные клетки. В этих экспериментах первичные клетки пациента с ОМЛ от 6 пациентов с мутациями TET2 из нашей когорты, которые прививаются, будут использоваться для создания лейкемии. Когда в крови будет наблюдаться развитие лейкемии (между 8-10 неделями), экспрессия MIF будет измерена в сыворотке мышей. Мыши будут случайным образом разделены на три группы по 7 мышей в группе: одна группа будет обработана коммерчески доступным ингибитором MIF (ISO-1), а вторая группа будет обработана антителом против MIF, и одна группа будет обработана носителем в течение трех недель. (одна инъекция в неделю). Затем за мышами будут наблюдать для выявления прелейкемического приживления трансплантата и развития ОМЛ с использованием еженедельного забора крови и окрашивания античеловеческим CD45.

Разработана модель ксенотрансплантации CD34+-клетками пуповинной крови, трансдуцированными лентивекторами, экспрессирующими кшРНК TET2. Эти сконструированные CD34-положительные клетки показали повышенную экспрессию и секрецию MIF и демонстрируют усиленное приживление мультилинейного NSG. Будет проверено, приводит ли ингибирование MIF с использованием ингибитора MIF или антитела против MIF к коррекции усиленного мультилинейного приживления NSG клетками, истощенными по TET2, по сравнению с контрольными клетками. Аналогичные эксперименты будут проведены с моделью, истощенной по DNMT3A, с использованием кшРНК DNMT3A, которые в настоящее время доступны в лаборатории. Кроме того, эффекты ингибирования MIF (ингибитором и антителом) и рекомбинантного человеческого MIF будут проанализированы в анализах репопуляции NSG необработанных нормальных клеток пуповинной крови CD34+.

1.6. Ингибирование MIF у мышей NSG, которым трансплантировали клетки пациентов в состоянии полной ремиссии с персистирующим клональным гемопоэзом (мутант DNMT3A/TET2) Образцы полной ремиссии от шести пациентов с персистирующим клональным гемопоэзом в полной ремиссии будут отобраны и обработаны, как в а), для проверки ингибирования MIF также способен противодействовать репопуляции NSG остаточными предлейкемическими стволовыми клетками.

Ожидается, что ингибирование MIF будет нарушать развитие ОМЛ у мышей. Однако стабильность и побочные эффекты анти-MIF-антитела или ингибиторов могут быть проблемой у леченных животных. В этом случае кшРНК будут использовать для нокдауна MIF в клетках ОМЛ перед инъекцией мышам NSG. Другой проблемой может быть необходимость совместной инъекции МСК во время ксенотрансплантации для повышения актуальности модели. При необходимости, нормальные МСК и МСК ОМЛ будут собраны, подготовлены и введены совместно с клетками ОМЛ.

1.7. Полная характеристика положительной регуляции MIF в истощенных по TET2 клетках. Как TET2 может влиять на регуляцию генов, еще не полностью изучено. Недавно команда Cao X показала, что потеря Tet2 приводит к усилению регуляции нескольких воспалительных медиаторов. В этой модели Tet2 рекрутирует Hdac2 и репрессирует транскрипцию Il6 посредством деацетилирования гистонов. Было обнаружено, что TET2 связывает проксимальный промотор гена MIF, который обогащен CpG-островками в клетках Касуми. Потеря TET2 приводит к накоплению MIF в нескольких моделях лейкемии через EGR1. i) Метилирование промотора MIF будет проанализировано путем секвенирования после обработки бисульфитом в нормальных клетках CD34+ (20 образцов) и популяциях клеток из AML, отсортированных, как в c) (150 образцов). ii) Экспрессия мРНК EGR1 будет проанализирована с помощью qRT-PCR в норме и Предлейкемические стволовые клетки ОМЛ, чтобы увидеть, существует ли корреляция с экспрессией MIF, наблюдаемая в других моделях. iii) Анализы ChIP-PCR с упором на промотор MIF будут выполняться для EGR1, H3K4me3, H3K27me3 и HDAC2 в контрольных образцах и образцах пациентов с ОМЛ. Если EGR1 не участвует в этой системе, анализ люциферазы промотора MIF будет использоваться для определения сайтов фактора транскрипции, которые необходимы для его положительной регуляции в образцах ОМЛ, и проверки мишеней с помощью ChIP-PCR. Все эти технологии доступны.

1.8. двунаправленная связь между МСК и клетками ОМЛ или нормальными HSPC. Влияние сверхэкспрессии MIF в клетках ОМЛ будет проверено на физиологию нормальных МСК (дифференцировку, поддержание гемопоэза, продукцию цитокинов/хемокинов, интерактом). Для этой цели нормальные первичные МСК из костного мозга взрослых (уже доступные) будут выделены и размножены, как описано (Reinisch A et al., Blood 2015, 125:249-260). Клетки будут амплифицировать до пассажа 2 (P2). МСК обрабатывают различными концентрациями рекомбинантного MIF в течение 24 и 48 часов и оценивают пролиферацию, продукцию цитокинов/хемокинов. Поскольку сообщалось, что MIF стимулирует гликолиз, эффекты MIF также будут расшифрованы в энергетическом метаболизме MSC путем измерения митохондриального дыхания и гликолиза MSC (анализатор внеклеточного потока Seahorse XF) и путем определения их MIF-индуцированного метаболизма. подпись с использованием высокопроизводительного мультиплексного снятия отпечатков пальцев (Omnilog Bilog). Чтобы смоделировать эффекты сверхэкспрессии MIF клетками ОМЛ, будут проведены эксперименты по совместному культивированию первичных клеток ОМЛ человека (5 образцов), которые экспрессируют или не экспрессируют (кшРНК) MIF. Через 24 и 48 часов МСК будут отсортированы и оценены их пролиферация, клеточный цикл и потенциал дифференцировки в остеобласты, адипоциты и хондроциты. Предыдущие исследования показывают, что MIF-CXCR4 является новой осью для рекрутирования МСК в опухоли in vivo.

Таким образом, будет изучено, может ли рекомбинантный MIF рекрутировать МСК с использованием анализов in vitro transwell. Влияние продукции MIF клетками ОМЛ на рекрутирование МСК будет проверено с использованием среды, кондиционированной ОМЛ. Клетки AML, сконструированные с помощью MIF shRNA, будут использоваться в этом контексте. Поскольку невозможно исключить, что МСК также могут способствовать продукции MIF, экспрессию мРНК будут тестировать с помощью первичных нормальных МСК, кокультурированных с клетками ОМЛ.

Ожидается, что рекомбинантный MIF будет влиять либо на пролиферацию, клеточный цикл, потенциал дифференцировки или миграцию МСК. Однако MIF, продуцируемый в микроокружении костного мозга, может также модифицировать биологию других популяций ниши стволовых клеток, включая остеобласты, эндотелиальные клетки или макрофаги. Чтобы исследовать альтернативные клетки, на которые MIF может оказывать влияние, будет проверено его влияние на эти популяции. МСК индуцируют дифференцироваться в остеобласты, адипоциты или хондроциты. Затем будет добавлен MIF для исследования пролиферации, клеточного цикла и миграции интересующих популяций. Воздействие на остеобласты и эндотелиальные клетки будет моделироваться с использованием клеточных линий MG63 и Huvec соответственно.

1.9. Исследуемая популяция 1.9.1. Набор участников 300 взрослых пациентов (> 18) с впервые диагностированным ОМЛ будут включены в исследование. В исследование ретроспективно будут включены 85 пациентов, у которых диагноз был поставлен с ноября 2015 года в больнице Сент-Антуан. 215 пациентов с впервые диагностированным ОМЛ в больницах Сент-Антуана и Университета Тура будут проспективно включены [> 100 пациентов с ОМЛ в год направляются в больницу Сент-Антуан (> 70 пациентов в год) и университетскую больницу Тура для лечения ОМЛ (> 30 пациентов в год). год)].

1.9.2. Последующие действия участника

Сбор образцов пациента:

В исследовании будут использоваться только стандартные образцы крови и костного мозга:

• Образцы крови для биохимии, подсчета клеток крови, иммунофенотипирования, цитогенетики, молекулярно-биологических анализов и криоконсервации банка опухолей
• Образцы костного мозга для иммунофенотипирования, цитогенетики, молекулярно-биологических анализов и криоконсервации банка опухолей

Точки времени:

Будут собираться только стандартные пробы времени оказания помощи:

• Момент времени диагностики (день 0, образец Dx)
• После первого курса химиотерапии (временная точка С1)
• После второго курса химиотерапии (временная точка С2)
• После третьего курса химиотерапии (временная точка С3)

• В случае рецидива или рефрактерности

  • во время диагностики первого рецидива или рефрактерности (RR1)
  • во время диагностики второго рецидива или рефрактерности (RR2)
• Контрольные образцы длительной ремиссии через 1, 2, 3 года после постановки диагноза (LTR1, 2, 3)