Implication du MIF dans la LBC (MIFAML)

L'étude vise à étudier l'implication du MIF dans la LAM chez l'adulte.

1. DESCRIPTION DE L'ÉLÉMENT OU DES ÉLÉMENTS SOUMIS À L'ENQUÊTE 1.1. Mesure des concentrations de MIF Plasma et surnageant de BM provenant de patients et de témoins (100 témoins appariés selon l'âge pour le sang et le plasma de BM, disponibles à l'hôpital de Tours, ClinicalTrials.gov #NCT02789839 ) seront analysés par ELISA. Les surnageants de BM seront obtenus après une procédure de centrifugation en 2 étapes : 1 mL de BM frais de patients AML ou de BM témoin sera centrifugé à 540 g pendant 5 min pour récupérer les cellules viables dans le culot (pour les études cytométriques et d'expression) ; le surnageant sera centrifugé à 1000 g/15 min/4°C pour préparer le plasma. Les concentrations de MIF dans le BM et le plasma sanguin seront systématiquement comparées. Étant donné que les concentrations de MIF peuvent être affectées par différents facteurs, notamment l'inflammation, la leucocytose et la monocytose, la numération des cellules sanguines et les taux plasmatiques de protéine C-réactive seront mesurés et pris en compte dans l'interprétation des données.

1.2. Mesure de l'expression de MIF, CD74 et CXCR4 Les cellules souches hématopoïétiques, les cellules progénitrices et les blastes de patients atteints de LAM seront triés selon l'expression des antigènes CD34, CD38, CD90, CD45-RA, IL-3R, en tenant compte de l'immunophénotype initial de la maladie. Les cellules souches hématopoïétiques et les cellules progénitrices des échantillons de MO de contrôle seront triées de la même manière. L'expression des ARN MIF, CD74 et CXCR4 sera étudiée par RT-PCR quantitative dans des sous-populations cellulaires triées. L'expression en surface du CXCR4 et des anti-CD74 ainsi que du CD74 intracellulaire sera étudiée par flux multiparamétrique avec cytométrie.

1.3. Analyse de l'expression de MIF, CD74, CXCR4 et des concentrations de MIF au moment de la rémission complète.

Les analyses réalisées en a) et b) seront répétées sur des échantillons en rémission complète chez 30 à 50 patients sélectionnés. Les patients seront sélectionnés en fonction de leur réponse au traitement (évaluation de la rémission complète et de la numération globulaire normale) et du génotype de leur maladie (15-25 patients avec des mutations TET2 ou DNMT3A au diagnostic vs 15-25 patients sans ces mutations) . Des échantillons seront prélevés après deux cycles de chimiothérapie au moment de l'évaluation de la rémission. Dans la mesure du possible, des contrôles de moelle osseuse de patients en rémission à long terme (> 1 an après le diagnostic) seront collectés et étudiés. En attendant, les techniques NGS, ddPCR, FISH ou RT-PCR seront utilisées pour évaluer la persistance ou l'absence des lésions initiales d'AML.

Il est prévu d'obtenir un matériel complet pour 80% des patients inclus rendant l'objectif de 240 patients atteignable en moins de trois ans. La purification cellulaire peut être un enjeu dans le cadre d'une LAM avec immunophénotype aberrant : cela sera pris en compte par l'utilisation de protocoles FACS adaptés. En ce qui concerne l'accent mis sur la voie MIF, il ne peut pas être exclu que d'autres chimiokines/cytokines, ou d'autres molécules puissent être impliquées dans la communication des cellules AML et de leur micro-environnement. Ainsi, des aliquotes de BM et de plasma sanguin seront cryoconservées pour permettre un affinement de notre stratégie (par exemple pour réaliser des puces à cytokines, des analyses ELISA, ou MS qui sont disponibles à l'hôpital Saint-Antoine).

1.4. Modèle de xénotransplantation d'AML primaire chez des souris NSG Des modèles de xénotransplantation de cellules d'AML primaires ont été développés dans une cohorte de 70 AML dans lesquels l'expression de MIF sera analysée, le génotype cytogénétique et moléculaire, et corrélera ces paramètres à différents phénotypes de greffe.

1.5. Inhibition du MIF chez les souris NSG transplantées avec des cellules AML et chez les souris NSG transplantées avec des HSPC de sang de cordon appauvris en TET2 ou DNMT3A Le rôle du MIF sur le développement de la leucémie chez les souris NSG xénogreffées avec des cellules primaires sera abordé. Dans ces expériences, des cellules primaires de patients atteints de LAM provenant de 6 patients porteurs de mutations TET2 de notre cohorte qui se grefferont seront utilisées pour générer une leucémie. Lorsque le développement leucémique sera observé dans le sang (entre 8 et 10 semaines), l'expression de MIF sera mesurée dans le sérum de souris. Les souris seront randomisées en trois groupes avec 7 souris par groupe : un groupe sera traité avec un inhibiteur de MIF disponible dans le commerce (ISO-1) et un deuxième groupe avec un anticorps anti-MIF et un groupe sera traité par le véhicule pendant trois semaines (une injection par semaine). Les souris seront ensuite surveillées pour détecter la prise de greffe pré-leucémique et le développement d'AML à l'aide d'un prélèvement sanguin hebdomadaire et d'une coloration anti-CD45 humaine.

Un modèle de xénotransplantation par des cellules CD34+ du sang de cordon transduites avec des lentivecteurs exprimant des shRNA TET2 a été développé. Ces cellules positives CD34 modifiées ont montré une expression et une sécrétion accrues de MIF et ont démontré une greffe NSG multilignée améliorée. Il sera testé si l'inhibition de MIF à l'aide d'un inhibiteur de MIF ou d'un anticorps anti-MIF conduit à une correction de la prise de greffe NSG multilignée améliorée par des cellules appauvries en TET2 par rapport aux cellules témoins. Des expériences similaires seront réalisées avec un modèle appauvri en DNMT3A en utilisant des shARN DNMT3A actuellement disponibles au laboratoire. De plus, les effets de l'inhibition du MIF (inhibiteur et anticorps) et du MIF humain recombinant seront analysés dans des tests de repeuplement NSG de cellules CD34+ normales non traitées du sang de cordon.

1.6. Inhibition du MIF chez des souris NSG transplantées avec des cellules de patients en rémission complète avec hématopoïèse clonale persistante (mutant DNMT3A / TET2) Des échantillons de rémission complète de six patients avec hématopoïèse clonale persistante en rémission complète seront sélectionnés et traités comme en a) pour tester si l'inhibition du MIF est également capable de contrecarrer le repeuplement de NSG par des cellules souches pré-leucémiques résiduelles.

On s'attend à ce que l'inhibition du MIF nuise au développement de l'AML chez la souris. Cependant, la stabilité et les effets secondaires des anticorps anti-MIF ou des inhibiteurs peuvent être un problème chez les animaux traités. Dans ce cas, les shARN seront utilisés pour éliminer le MIF dans les cellules AML avant l'injection aux souris NSG. Un autre problème peut être la nécessité d'une co-injection de CSM au moment de la xénotransplantation pour accroître la pertinence du modèle. Si nécessaire, des MSC normaux et des MSC AML seront collectés, préparés et co-injectés avec des cellules AML.

1.7. Caractérisation complète de la régulation à la hausse du MIF dans les cellules appauvries en TET2 L'impact que TET2 pourrait avoir sur la régulation des gènes n'est toujours pas complètement compris. Récemment, l'équipe de Cao X a montré que la perte de Tet2 entraînait la régulation à la hausse de plusieurs médiateurs inflammatoires. Dans ce modèle, Tet2 a recruté Hdac2 et réprimé la transcription de Il6 via la désacétylation des histones. Il a été découvert que TET2 se lie au promoteur proximal du gène MIF qui est enrichi en îlots CpG dans les cellules de Kasumi. La perte de TET2 entraîne une accumulation de MIF dans plusieurs modèles leucémiques via EGR1. i) La méthylation du promoteur MIF sera analysée par séquençage après traitement au bisulfite dans des cellules CD34+ normales (20 échantillons) et des populations cellulaires d'AML triées comme en c) (150 échantillons) ii) L'expression de l'ARNm EGR1 sera analysée par qRT-PCR dans des cellules normales et Cellules souches pré-leucémiques AML pour voir s'il existe une corrélation avec l'expression de MIF, comme observé dans d'autres modèles iii) Des analyses ChIP-PCR axées sur le promoteur MIF seront effectuées pour EGR1, H3K4me3, H3K27me3 et HDAC2 dans des échantillons de patients témoins et AML. Si EGR1 n'est pas impliqué dans ce système, le dosage de la luciférase du promoteur MIF sera utilisé pour identifier les sites des facteurs de transcription qui sont essentiels à sa régulation positive dans les échantillons d'AML et valider les cibles par ChIP-PCR. Toutes ces technologies sont disponibles.

1.8. communication bidirectionnelle entre les CSM et les cellules AML ou HSPC normales L'impact de la surexpression de MIF dans les cellules AML sera testé sur la physiologie des CSM normales (différenciation, maintien de l'hématopoïèse, production de cytokines/chimiokines, interactome). Dans ce but, des CSM primaires normales de moelle osseuse adulte (déjà disponibles) seront isolées et développées comme décrit (Reinisch A et al, Blood 2015, 125 : 249-260). Les cellules seront amplifiées jusqu'au passage 2 (P2). Les CSM seront traitées avec différentes concentrations de MIF recombinant pendant 24 et 48 heures et la prolifération, la production de cytokines/chimiokines seront évaluées. Comme il a été rapporté que le MIF stimule la glycolyse, les effets du MIF seront également déchiffrés dans le métabolisme énergétique des MSC en mesurant la respiration mitochondriale et la glycolyse des MSC (analyseur de flux extracellulaire Seahorse XF) et en déterminant leur métabolisme induit par le MIF. signature par empreinte multiplexée à haut débit (Omnilog Biolog). Afin de modéliser les effets de la surexpression du MIF par les cellules AML, nous réaliserons des expériences de co-culture entre des cellules AML primaires humaines (5 échantillons) exprimant ou non (shRNA) du MIF. Après 24 et 48 heures, les CSM seront triées et leur potentiel de prolifération, de cycle cellulaire et de différenciation en ostéoblastes, adipocytes et chondrocytes sera évalué. Des études antérieures indiquent que MIF-CXCR4 est un nouvel axe pour le recrutement de MSC dans les tumeurs in vivo.

Ainsi, il sera étudié si le MIF recombinant peut recruter des MSC en utilisant des tests transwell in vitro. L'effet de la production de MIF par les cellules AML sur le recrutement des CSM sera testé en utilisant un milieu conditionné AML. Les cellules AML modifiées avec le shRNA MIF seront utilisées dans ce contexte. Comme il ne peut pas exclure que les MSC puissent également contribuer à la production de MIF, l'expression de l'ARNm sera testée par des MSC normales primaires co-cultivées avec des cellules AML.

On s'attend à ce que le MIF recombinant ait un impact sur la prolifération, le cycle cellulaire, le potentiel de différenciation ou la migration des MSC. Cependant, le MIF produit dans le microenvironnement BM pourrait également modifier la biologie d'autres populations de la niche des cellules souches, notamment les ostéoblastes, les cellules endothéliales ou les macrophages. Afin d'étudier des cellules alternatives sur lesquelles le MIF peut avoir un impact, il s'agira de tester ses effets sur ces populations. Les CSM seront amenées à se différencier en ostéoblastes, adipocytes ou chondrocytes. Le MIF sera ensuite ajouté pour étudier la prolifération, le cycle cellulaire et la migration des populations d'intérêt. L'effet sur les ostéoblastes et les cellules endothéliales sera modélisé en utilisant respectivement les lignées cellulaires MG63 et Huvec.

1.9. Population étudiée 1.9.1. Recrutement des participants 300 patients adultes (>18 ans) nouvellement diagnostiqués avec une LAM seront inclus dans l'étude. 85 patients diagnostiqués depuis novembre 2015 à l'hôpital Saint-Antoine seront rétrospectivement inclus dans l'étude. 215 patients nouvellement diagnostiqués LAM aux CHU Saint-Antoine et Tours seront inclus de manière prospective [>100 patients LAM par an sont référés à l'hôpital Saint-Antoine (>70 patients par an) et au CHU de Tours pour LAM (>30 patients par an)].

1.9.2. Suivi des participants

Prélèvement d'échantillons de patients :

Seuls les échantillons de sang et de moelle osseuse de soins standard seront utilisés dans l'étude :

• Échantillons sanguins pour la biochimie, la numération globulaire, l'immunophénotypage, la cytogénétique, les analyses de biologie moléculaire et la cryoconservation des banques de tumeurs
• Échantillons de moelle osseuse pour l'immunophénotypage, la cytogénétique, les analyses de biologie moléculaire et la cryoconservation des banques de tumeurs

Points de temps:

Seuls les échantillons de point de temps de soins standard seront collectés :

• Moment du diagnostic (jour 0, échantillon Dx)
• Après le premier cycle de chimiothérapie (point C1)
• Après la deuxième cure de chimiothérapie (point temporel C2)
• Après le troisième cycle de chimiothérapie (point temporel C3)

• En cas de rechute ou de réfractaire,

  • au moment du diagnostic de première rechute ou réfractaire (RR1)
  • au moment du diagnostic de deuxième rechute ou réfractaire (RR2)
• Échantillons de contrôle de rémission à long terme à 1, 2, 3 ans après le diagnostic (LTR1, 2, 3)