MIF osallistuminen AML:ään (MIFAML)

Tutkimuksen tavoitteena on selvittää MIF:n osallistumista aikuisten AML:ään.

1. TUTKIMUKSEN OLEVAN ELEMENTIN KUVAUS 1.1. MIF-pitoisuuksien mittaaminen Plasma- ja BM-supernatantti potilailta ja kontrolleilta (100 iän mukaista kontrollia verelle ja BM-plasmalle, saatavilla Toursin sairaalasta, ClinicalTrials.gov #NCT02789839 ) analysoidaan ELISA:lla. BM-supernatantit saadaan 2-vaiheisen sentrifugointimenettelyn jälkeen: 1 ml tuoretta BM-solua AML-potilailta tai kontrolli-BM sentrifugoidaan 540 g:llä 5 minuuttia elävien solujen talteenottamiseksi pelletistä (sytometrisiä ja ilmentymistutkimuksia varten); supernatantti sentrifugoidaan nopeudella 1000 g/15 min/4 °C plasman valmistamiseksi. BM:n ja veriplasman MIF-pitoisuuksia verrataan systemaattisesti. Koska MIF-pitoisuuksiin voivat vaikuttaa erilaiset tekijät, kuten tulehdus, leukosytoosi ja monosytoosi, verisolujen määrä ja plasman C-reaktiivisen proteiinin tasot mitataan ja otetaan huomioon tietojen tulkinnassa.

1.2. MIF-, CD74- ja CXCR4-ilmentymisen mittaaminen AML-potilaiden hematopoieettiset kantasolut, progenitorisolut ja blastit lajitellaan CD34-, CD38-, CD90-, CD45-RA-, IL-3R-antigeenien ilmentymisen mukaan ottaen huomioon antigeenin alkuperäinen immunofenotyyppi. tauti. Kontrolli-BM-näytteistä saadut hematopoieettiset kantasolut ja progenitorisolut lajitellaan samalla tavalla. MIF-, CD74- ja CXCR4-RNA:n ilmentymistä tutkitaan kvantitatiivisella RT-PCR:llä lajitelluissa solualapopulaatioissa. CXCR4:n ja anti-CD74:n sekä solunsisäisen CD74:n pintaekspressiota tutkitaan moniparametrisella virtauksella sytometrialla.

1.3. MIF-, CD74-, CXCR4-ilmentymisen ja MIF-pitoisuuksien analyysi täydellisen remission aikana.

Kohdissa a) ja b) suoritetut analyysit toistetaan täydellisissä remissionäytteissä 30–50 valitulla potilaalla. Potilaat valitaan heidän hoitovasteensa (täydellisen remission ja normaalin verenkuvan arviointi) ja sairautensa genotyypin mukaan (15-25 potilasta, joilla on joko TET2- tai DNMT3A-mutaatioita diagnoosin yhteydessä, vs. 15-25 potilasta, joilla ei ole näitä mutaatioita). . Näytteet kerätään kahden kemoterapiakurssin jälkeen remissioarvioinnin aikana. Aina kun mahdollista, pitkäaikaisessa remissiossa (> 1 vuosi diagnoosin jälkeen) potilailta kerätään ja tutkitaan luuydinkontrollit. Sillä välin NGS-, ddPCR-, FISH- tai RT-PCR-tekniikoita käytetään arvioimaan alkuperäisten AML-leesioiden pysyvyyttä tai puuttumista.

On odotettavissa, että täydellinen materiaali saadaan 80 %:lle mukana olevista potilaista, joten tavoite 240 potilasta voidaan saavuttaa alle kolmessa vuodessa. Solujen puhdistaminen voi olla ongelma AML:n yhteydessä, jolla on poikkeava immunofenotyyppi: tämä otetaan huomioon käyttämällä asianmukaisia ​​FACS-protokollia. Mitä tulee MIF-reittiin keskittymiseen, ei voida sulkea pois sitä, että muut kemokiinit/sytokiinit tai muut molekyylit voivat olla mukana AML-solujen ja niiden mikroympäristön kommunikaatiossa. Siten BM- ja veriplasman alikvootit kylmäsäilytetään strategiamme parantamiseksi (esimerkiksi sytokiiniryhmien, ELISA- tai MS-analyysien suorittamiseksi, jotka ovat saatavilla Saint-Antoinen sairaalasta).

1.4. Primaarisen AML:n ksenotransplantaatiomalli NSG-hiirillä Primaaristen AML-solujen ksenotransplantaatiomallit on kehitetty 70 AML:n kohortissa, joissa analysoidaan MIF-ilmentymistä, sytogeneettistä ja molekyyligenotyyppiä ja korreloivat nämä parametrit erilaisiin siirtofenotyyppeihin.

1.5. MIF:n esto NSG-hiirillä, joille on siirretty AML-soluja, ja NSG-hiirissä, joihin on siirretty napanuoraveren HSPC:itä, joista TET2 on poistettu tai DNMT3A:sta. Näissä kokeissa käytetään leukemian synnyttämiseen primaarisia AML-potilassoluja kuudesta potilaasta, joilla on kohorttimme TET2-mutaatioita. Kun veressä havaitaan leukemian kehittymistä (8-10 viikkoa), MIF:n ilmentyminen mitataan hiirten seerumissa. Hiiret satunnaistetaan kolmeen ryhmään, joissa on 7 hiirtä ryhmää kohden: Yhtä ryhmää hoidetaan kaupallisesti saatavalla MIF-inhibiittorilla (ISO-1) ja toista ryhmää anti-MIF-vasta-aineella ja yhtä ryhmää hoidetaan vehikkelillä kolmen viikon ajan. (yksi injektio viikossa). Sen jälkeen hiiriä tarkkaillaan esileukeemisen siirteen ja AML:n kehittymisen havaitsemiseksi käyttämällä viikoittaisia ​​verinäytteitä ja anti-ihmisen CD45-värjäystä.

On kehitetty malli ksenotransplantaatiosta napanuoraveren CD34+-soluilla, jotka on transdusoitu lentivektoreilla, jotka ilmentävät TET2 shRNA:ita. Nämä muokatut CD34-positiiviset solut osoittivat lisääntynyttä MIF-ilmentymistä ja -eritystä ja osoittivat parantuneen monilinjaisen NSG-siirteen. Il testataan, johtaako MIF:n estäminen käyttämällä MIF-inhibiittoria tai anti-MIF-vasta-ainetta tehostetun monilinjaisen NSG-siirteen korjaamiseen TET2-vajautuneilla soluilla verrattuna kontrollisoluihin. Samanlaisia ​​kokeita suoritetaan DNMT3A-tyhjennetyllä mallilla käyttäen DNMT3A shRNA:ita, jotka ovat tällä hetkellä saatavilla laboratoriossa. Lisäksi MIF-estämisen (inhibiittori ja vasta-aine) ja ihmisen rekombinantin MIF:n vaikutukset analysoidaan käsittelemättömien normaalien napanuoraveren CD34+-solujen NSG-repopulaatiomäärityksissä.

1.6. MIF-inhibitio NSG-hiirillä, joille on siirretty soluja potilailta, joilla on täydellinen remissio ja jatkuva klooninen hematopoieesi (DNMT3A / TET2-mutantti) Täydelliset remissionäytteet kuudesta potilaasta, joilla on jatkuva klooninen hematopoieesi täydellisessä remissiossa, valitaan ja niitä käsitellään kuten kohdassa a) sen testaamiseksi, onko MIF-inhibiitio pystyy myös estämään NSG-uudelleenpopulaation esileukeemisten kantasolujen jäännöksillä.

On odotettavissa, että MIF:n eston heikentää AML:n kehittymistä hiirillä. Anti-MIF-vasta-aineen tai estäjien stabiilius ja sivuvaikutukset voivat kuitenkin olla ongelma hoidetuissa eläimissä. Tässä tapauksessa shRNA:ita käytetään MIF:n kumoamiseen AML-soluissa ennen injektiota NSG-hiiriin. Toinen ongelma voi olla MSC:iden yhteisinjektio ksenotransplantaation aikana mallin merkityksen lisäämiseksi. Tarvittaessa normaalit MSC:t ja AML MSC:t kerätään, valmistetaan ja injektoidaan yhdessä AML-solujen kanssa.

1.7. MIF:n ylössäätelyn täydellinen karakterisointi TET2-vajautuneissa soluissa Miten TET2 voi vaikuttaa geenisääntelyyn, ei ole vielä täysin ymmärretty. Äskettäin Cao X:n tiimi on osoittanut, että Tet2:n menetys johti useiden tulehdusvälittäjien säätelyyn. Tässä mallissa Tet2 värväsi Hdac2:n ja tukahdutti Il6:n transkription histonideasetyloinnin kautta. On havaittu, että TET2 sitoutuu MIF-geenin proksimaaliseen promoottoriin, joka on rikastunut CpG-saarilla Kasumi-soluissa. TET2:n menetys johtaa MIF:n kertymiseen useissa leukemiamalleissa EGR1:n kautta. i) MIF-promoottorin metylaatio analysoidaan sekvensoimalla bisulfiittikäsittelyn jälkeen normaaleissa CD34+-soluissa (20 näytettä) ja AML-solupopulaatioissa, jotka on lajiteltu kohdan c) mukaisesti (150 näytettä) ii) EGR1-mRNA:n ilmentyminen analysoidaan qRT-PCR:llä normaaleissa ja AML:n esileukemiakantasolut, jotta nähdään, onko korrelaatio MIF-ilmentymisen kanssa, kuten muissa malleissa havaittiin. iii) MIF-promoottoriin keskittyvät ChIP-PCR-analyysit suoritetaan EGR1:lle, H3K4me3:lle, H3K27me3:lle ja HDAC2:lle kontrolli- ja AML-potilasnäytteissä. Jos EGR1 ei ole mukana tässä systeemissä, MIF-promoottorilusiferaasimääritystä käytetään tunnistamaan transkriptiotekijäkohdat, jotka ovat välttämättömiä sen ylössäätelylle AML-näytteissä ja validoimaan kohteet ChIP-PCR:llä. Kaikki nämä tekniikat ovat saatavilla.

1.8 kaksisuuntainen viestintä MSC-solujen ja AML-solujen tai normaalien HSPC:iden välillä MIF-yli-ilmentymisen vaikutusta AML-soluissa testataan normaalien MSC-solujen fysiologiaan (erilaistuminen, hematopoieesin ylläpitäminen, sytokiinien/kemokiinien tuotanto, interaktomi). Tätä tarkoitusta varten normaalit primaariset MSC:t aikuisen luuytimestä (jo saatavilla) eristetään ja laajennetaan kuvatulla tavalla (Reinisch A et ai, Blood 2015, 125:249-260). Solut vahvistetaan jaksoon 2 asti (P2). MSC:itä käsitellään eri pitoisuuksilla rekombinantti-MIF:llä 24 ja 48 tunnin ajan, ja proliferaatiota ja sytokiinien/kemokiinien tuotantoa arvioidaan. Koska on raportoitu, että MIF stimuloi glykolyysiä, MIF:n vaikutukset selvitetään myös MSC:iden energisessä aineenvaihdunnassa mittaamalla MSC:iden mitokondriaalista hengitystä ja glykolyysiä (Seahorse XF ekstrasellulaarinen virtausanalysaattori) ja määrittämällä niiden MIF-indusoitu aineenvaihdunta. allekirjoitus käyttämällä korkean suorituskyvyn multipleksoitua sormenjälkeä (Omnilog Biolog). AML-solujen MIF-yli-ilmentämisen vaikutusten mallintamiseksi suorittaa yhteisviljelykokeita ihmisen primääristen AML-solujen välillä (5 näytettä), jotka ilmentävät tai eivät (shRNA) MIF:ää. 24 ja 48 tunnin kuluttua MSC:t lajitellaan ja niiden proliferaatio, solusykli ja erilaistumispotentiaali osteoblasteiksi, rasvasoluiksi ja kondrosyyteiksi arvioidaan. Aiemmat tutkimukset osoittavat, että MIF-CXCR4 on uusi akseli MSC:n rekrytoimiseksi kasvaimiin in vivo.

Siten tutkitaan, voiko rekombinantti MIF värvätä MSC:itä käyttämällä in vitro transwell-määrityksiä. AML-solujen MIF-tuotannon vaikutus MSC:iden rekrytointiin testataan käyttämällä AML-käsiteltyä väliainetta. MIF shRNA:lla muokattuja AML-soluja käytetään tässä yhteydessä. Koska ei voida sulkea pois sitä, että MSC:t voivat myös edistää MIF-tuotantoa, mRNA:n ilmentyminen testataan primaarisella normaalilla MSC:llä, jota viljellään yhdessä AML-solujen kanssa.

Odotetaan, että yhdistelmä-MIF:llä on vaikutusta joko proliferaatioon, solusykliin, erilaistumispotentiaaliin tai MSC:iden migraatioon. BM-mikroympäristössä tuotettu MIF voisi kuitenkin myös muokata muiden kantasolupopulaatioiden biologiaa, mukaan lukien osteoblastit, endoteelisolut tai makrofagit. Selvittääkseen vaihtoehtoisia soluja, joihin MIF voi vaikuttaa, se testaa sen vaikutuksia näihin populaatioihin. MSC:t indusoidaan erilaistumaan osteoblasteiksi, adiposyyteiksi tai kondrosyyteiksi. MIF lisätään sitten tutkimaan kiinnostuksen kohteena olevien populaatioiden lisääntymistä, solusykliä ja migraatiota. Vaikutus osteoblasteihin ja endoteelisoluihin mallinnetaan käyttämällä vastaavasti MG63- ja Huvec-solulinjoja.

1.9. Tutkimuspopulaatio 1.9.1. Osallistujien rekrytointi Tutkimukseen otetaan mukaan 300 aikuista potilasta (>18), joilla on äskettäin diagnosoitu AML. Tutkimukseen otetaan takautuvasti mukaan 85 potilasta, jotka on diagnosoitu marraskuusta 2015 lähtien Saint-Antoinen sairaalassa. 215 potilasta, joilla on hiljattain diagnosoitu AML Saint-Antoinen ja Toursin yliopiston sairaaloissa, otetaan mukaan [>100 AML-potilasta vuodessa ohjataan Saint-Antoinen sairaalaan (> 70 potilasta vuodessa) ja Toursin yliopistolliseen sairaalaan AML:n vuoksi (> 30 potilasta per vuosi). vuosi)].

1.9.2. Osallistujan seuranta

Potilasnäytekokoelma:

Tutkimuksessa käytetään vain tavanomaisia ​​hoitoveri- ja luuydinnäytteitä:

• Verinäytteet biokemiaa, verisolujen määrää, immunofenotyypitystä, sytogenetiikkaa, molekyylibiologisia analyysejä ja kasvainpankkien kylmäsäilytystä varten
• Luuydinnäytteet immunofenotyypitykseen, sytogenetiikkaan, molekyylibiologian analyyseihin ja kasvainpankkien kylmäsäilytykseen

Aikapisteet:

Vain normaalin hoitoajankohdan näytteet kerätään:

• Diagnoosiajankohta (päivä 0, Dx näyte)
• Ensimmäisen kemoterapiajakson jälkeen (C1-aikapiste)
• Toisen kemoterapiajakson jälkeen (C2-aikapiste)
• Kolmannen kemoterapiajakson jälkeen (C3-aikapiste)

• Uusiutumisen tai refraktiorin tapauksessa

  • ensimmäisen relapsin tai refraktiorin diagnoosin yhteydessä (RR1)
  • toisen relapsin tai refraktoriteetin (RR2) diagnoosin yhteydessä
• Pitkäaikaiset remissiokontrollinäytteet 1, 2, 3 vuoden kuluttua diagnoosista (LTR1, 2, 3)