MIF részvétel az AML-ben (MIFAML)

A tanulmány célja a MIF felnőttkori AML-ben való részvételének tanulmányozása.

1. A VIZSGÁLT ELEM VAGY ELEMEK LEÍRÁSA 1.1. MIF-koncentrációk mérése A betegek és a kontrollok plazma- és BM-felülúszója (100 korosztályos kontroll vér és testtömeg-plazma számára, elérhető a Tours Hospital, ClinicalTrials.gov címen #NCT02789839) ELISA-val elemezzük. A BM felülúszót egy 2-lépéses centrifugálási eljárás után nyerjük ki: 1 ml friss BM-et AML-betegekből vagy kontroll BM-et centrifugálunk 540 g-vel 5 percig, hogy kinyerjük az életképes sejteket a pelletben (citometriás és expressziós vizsgálatokhoz); a felülúszót 1000 g/15 perc/4°C-on centrifugáljuk a plazma elkészítéséhez. A BM-ben és a vérplazmában mért MIF-koncentrációkat szisztematikusan összehasonlítják. Mivel a MIF-koncentrációkat különböző tényezők befolyásolhatják, beleértve a gyulladást, a leukocitózist és a monocitózist, a vérsejtszámot és a plazma C-reaktív fehérjeszintjét mérik, és figyelembe veszik az adatok értelmezésekor.

1.2. MIF, CD74 és CXCR4 expresszió mérése Az AML-betegekből származó vérképző őssejteket, progenitor sejteket és blasztokat a CD34, CD38, CD90, CD45-RA, IL-3R antigének expressziója szerint válogatjuk, figyelembe véve a kezdeti immunfenotípust. a betegség. A kontroll BM mintákból származó vérképző őssejteket és progenitor sejteket hasonló módon válogatjuk szét. A MIF, CD74 és CXCR4 RNS expresszióját kvantitatív RT-PCR-rel vizsgáljuk szétválogatott sejtalpopulációkban. A CXCR4 és az anti-CD74, valamint az intracelluláris CD74 felszíni expresszióját többparaméteres áramlással, citometriával vizsgáljuk.

1.3. A MIF, CD74, CXCR4 expresszió és MIF koncentráció elemzése a teljes remisszió idején.

Az a) és b) pontban elvégzett elemzéseket 30-50 kiválasztott beteg teljes remissziós mintájában megismétlik. A betegeket a terápiára adott válasz (a teljes remisszió és a normál vérkép felmérése), valamint a betegségük genotípusa alapján választják ki (15-25 beteg TET2 vagy DNMT3A mutációval a diagnóziskor, szemben a 15-25 beteggel, akiknél ezek a mutációk nincsenek). . A mintákat két kemoterápiás kúra után veszik a remisszió értékelésének időpontjában. Amikor csak lehetséges, a hosszú távú remisszióban (> 1 évvel a diagnózis után) betegek csontvelő-kontrolljait össze kell gyűjteni és tanulmányozni. Addig is NGS, ddPCR, FISH vagy RT-PCR technikákat alkalmaznak a kezdeti AML elváltozások fennmaradásának vagy hiányának értékelésére.

Várhatóan a bevont betegek 80%-áról teljes anyagot kapnak majd, így a 240 beteg célkitûzése kevesebb mint három éven belül elérhető. A sejttisztítás problémát jelenthet az aberráns immunfenotípusú AML kontextusában: ezt a megfelelő FACS protokollok használatával figyelembe veszik. Ami a MIF útvonalat illeti, nem zárható ki, hogy más kemokinek/citokinek vagy más molekulák is részt vehetnek az AML sejtek és mikrokörnyezetük kommunikációjában. Így a BM és a vérplazma aliquot részeit mélyhűtve tartósítják, hogy lehetővé tegyük stratégiánk finomítását (például citokin-elrendezések, ELISA vagy MS-elemzések elvégzéséhez, amelyek a Saint-Antoine Kórházban elérhetők).

1.4. Az elsődleges AML xenotranszplantációs modellje NSG egerekben Az elsődleges AML sejtek xenotranszplantációs modelljeit egy 70 AML-ből álló kohorszban fejlesztették ki, amelyben a MIF expresszióját, a citogenetikai és molekuláris genotípust elemezzük, és ezeket a paramétereket korreláljuk a különböző beültetési fenotípusokkal.

1.5. MIF gátlás AML sejtekkel átültetett NSG egerekben és TET2-kimerült vagy DNMT3A-mentes köldökzsinórvér-HSPC-vel átültetett NSG egerekben A MIF szerepe a leukémia kialakulásában primer sejtekkel xenotranszplantált NSG egerekben. Ezekben a kísérletekben 6 olyan beteg primer AML-beteg sejtjeit használjuk fel, akiknél a beültetett kohorsz TET2-mutációja volt, a leukémia generálására. Amikor leukémia kialakulása látható a vérben (8-10 hét között), a MIF-expressziót az egerek szérumában mérik. Az egereket véletlenszerűen három csoportba osztják, csoportonként 7 egeret: az egyik csoportot kereskedelmi forgalomban kapható MIF-inhibitorral (ISO-1), a másik csoportot pedig anti-MIF antitesttel, egy csoportot pedig vivőanyaggal kezelnek három hétig. (heti egy injekció). Ezután az egereket monitorozni fogják a leukémia előtti beültetés és az AML kialakulásának kimutatására heti vérminta és anti-humán CD45 festéssel.

Kidolgozták a TET2 shRNS-t expresszáló lentivektorokkal transzdukált köldökzsinórvér CD34+ sejtek xenotranszplantációjának modelljét. Ezek a módosított CD34 pozitív sejtek fokozott MIF-expressziót és szekréciót mutattak, és fokozott többvonalas NSG-beültetést mutattak. Megvizsgáljuk, hogy a MIF gátlása MIF inhibitorral vagy anti-MIF antitesttel a TET2-hiányos sejtek fokozott többvonalas NSG-beültetésének korrekciójához vezet-e a kontrollsejtekkel összehasonlítva. Hasonló kísérleteket hajtanak végre egy DNMT3A-mentes modellel is, a jelenleg a laboratóriumban elérhető DNMT3A shRNS-ek felhasználásával. Ezen túlmenően a MIF-gátlás (inhibitor és antitest) és a rekombináns humán MIF hatásait feldolgozatlan normál köldökzsinórvér CD34+-sejtek NSG-repopulációs vizsgálataiban elemzik.

1.6. MIF-gátlás NSG egerekben, amelyekbe perzisztens klonális vérképzéssel rendelkező, teljes remisszióban lévő betegek sejtjeit transzplantáltuk (DNMT3A / TET2 mutáns) Hat, teljes remisszióban lévő, perzisztens klonális vérképzésben szenvedő beteg teljes remissziós mintáit kiválasztják és az a) pontban leírtak szerint kezelik a MIF-gátlás tesztelésére. képes ellensúlyozni a pre-leukémiás őssejtek által okozott NSG-repopulációt is.

Várható, hogy a MIF gátlása rontja az AML fejlődését egerekben. Az anti-MIF antitestek vagy inhibitorok stabilitása és mellékhatásai azonban problémát jelenthetnek a kezelt állatokban. Ebben az esetben shRNS-eket használnak a MIF leállítására az AML sejtekben, mielőtt NSG egerekbe injektálják. Egy másik probléma lehet az MSC-k együttes injektálásának szükségessége a xenotranszplantáció idején a modell relevanciájának növelése érdekében. Ha szükséges, normál MSC-ket és AML MSC-ket gyűjtenek össze, készítenek elő, és együtt injektálják az AML sejtekkel.

1.7. A TET2-vel kimerült sejtekben a MIF-szabályozás teljes jellemzése, hogy a TET2 hogyan befolyásolhatja a génszabályozást, még mindig nem teljesen tisztázott. A közelmúltban Cao X csapata kimutatta, hogy a Tet2 elvesztése számos gyulladásos mediátor felszabályozását eredményezte. Ebben a modellben a Tet2 felvette a Hdac2-t, és elnyomta az Il6 transzkripcióját hiszton-dezacetilációval. Azt találták, hogy a TET2 a MIF gén proximális promoteréhez kötődik, amely a Kasumi sejtekben található CpG-szigetekben gazdag. A TET2 elvesztése több leukémiás modellben MIF-felhalmozódást eredményez az EGR1-en keresztül. i) A MIF-promóter metilációját szekvenálással elemezzük hidrogén-szulfit kezelés után normál CD34+ sejtekben (20 minta) és AML-ekből származó sejtpopulációk a c) pont szerint válogatva (150 minta) ii) Az EGR1 mRNS expresszióját qRT-PCR-rel analizáljuk normál és AML pre-leukémiás őssejtek, hogy lássák, van-e összefüggés a MIF expresszióval, ahogy azt más modellekben is megfigyelték. iii) ChIP-PCR elemzéseket végeznek a MIF promoterre összpontosítva az EGR1, H3K4me3, H3K27me3 és HDAC2 esetében a kontroll és az AML betegmintákban. Ha az EGR1 nem vesz részt ebben a rendszerben, akkor MIF-promoter luciferáz vizsgálatot alkalmaznak a transzkripciós faktor helyek azonosítására, amelyek elengedhetetlenek az AML-mintákban történő felszabályozásához, és a célpontokat ChIP-PCR-rel validálják. Mindezek a technológiák rendelkezésre állnak.

1.8. kétirányú kommunikáció MSC-k és AML-sejtek vagy normál HSPC-k között. A MIF-túlexpresszió AML-sejtekben való hatását a normál MSC-k fiziológiájára (differenciálódás, hematopoiesis fenntartása, citokinek/kemokinek termelése, interaktóma) vizsgáljuk. Ebből a célból a felnőtt csontvelőből származó normál primer MSC-ket (már elérhető) izolálják és kiterjesztik a leírtak szerint (Reinisch A és munkatársai, Blood 2015, 125:249-260). A sejteket a 2. passzázsig (P2) felerősítjük. Az MSC-ket különböző koncentrációjú rekombináns MIF-fel kezelik 24 és 48 órán keresztül, és értékelik a proliferációt, a citokinek/kemokinek termelését. Mivel arról számoltak be, hogy a MIF serkenti a glikolízist, a MIF hatásait az MSC-k energetikai metabolizmusában is megfejtik az MSC-k mitokondriális légzésének és glikolízisének mérésével (Seahorse XF extracelluláris fluxusanalizátor), valamint a MIF-indukált metabolikus folyamatok meghatározásával. aláírás nagy teljesítményű multiplexelt ujjlenyomat segítségével (Omnilog Biolog). Az AML-sejtek által okozott MIF-túlexpresszió hatásainak modellezésére közös tenyésztési kísérleteket fog végezni olyan humán primer AML-sejtek között (5 minta), amelyek expresszálnak vagy sem (shRNS) MIF-et. 24 és 48 óra elteltével az MSC-ket szétválogatják, és értékelik proliferációjukat, sejtciklusukat és oszteoblasztokká, zsírsejtekké és porcsejtekké való differenciálódási potenciáljukat. Korábbi tanulmányok azt mutatják, hogy a MIF-CXCR4 egy új tengely az MSC tumorok in vivo toborzására.

Így azt vizsgáljuk meg, hogy a rekombináns MIF képes-e MSC-ket toborozni in vitro transzwell vizsgálatok segítségével. Az AML-sejtek MIF-termelésének az MSC-k toborzására gyakorolt ​​hatását AML kondicionált táptalaj segítségével teszteljük. Ebben az összefüggésben MIF shRNS-sel módosított AML-sejteket használunk. Mivel nem zárható ki, hogy az MSC-k is hozzájárulhatnak a MIF-termeléshez, az mRNS expresszióját az AML sejtekkel együtt tenyésztett elsődleges normál MSC-vel tesztelik.

A rekombináns MIF várhatóan hatással lesz az MSC-k proliferációjára, sejtciklusára, differenciációs potenciáljára vagy migrációjára. A BM mikrokörnyezetben termelt MIF azonban módosíthatja az őssejt-rés más populációinak biológiáját is, beleértve az oszteoblasztokat, endoteliális sejteket vagy makrofágokat. Annak érdekében, hogy megvizsgáljuk az alternatív sejteket, amelyekre a MIF hatással lehet, tesztelni fogják annak hatásait ezekre a populációkra. Az MSC-k oszteoblasztokká, zsírsejtekké vagy kondrocitákká differenciálódnak. Ezután MIF-et adnak hozzá a proliferáció, a sejtciklus és az érdeklődésre számot tartó populációk migrációjának vizsgálatára. Az oszteoblasztokra és endoteliális sejtekre gyakorolt ​​hatást MG63 és Huvec sejtvonalak segítségével modellezzük.

1.9. Vizsgálati populáció 1.9.1. A résztvevők toborzása 300 újonnan AML-sel diagnosztizált felnőtt beteget (>18) vonnak be a vizsgálatba. 85 beteget, akiket 2015 novembere óta diagnosztizáltak a Saint-Antoine Kórházban, visszamenőlegesen bevonnak a vizsgálatba. A Saint-Antoine és Tours Egyetem kórházaiban újonnan diagnosztizált AML-ben szenvedő 215 beteget prospektívan bevonnak [>évente 100 AML-beteget küldenek a Saint-Antoine kórházba (évente >70 beteg) és a Tours Egyetemi Kórházba AML miatt (>30 beteg/évente). év)].

1.9.2. A résztvevők nyomon követése

Beteg mintagyűjtés:

A vizsgálat során csak a szokásos vér- és csontvelőmintákat használjuk:

• Vérminták biokémiához, vérsejtszámokhoz, immunfenotipizáláshoz, citogenetikai, molekuláris biológiai elemzésekhez és tumorbank krioprezervációjához
• Csontvelőminták immunfenotipizáláshoz, citogenetikai, molekuláris biológiai elemzésekhez és tumorbank krioprezerválásához

Időpontok:

Csak a szokásos gondozási időpontokban mintákat gyűjtünk:

• Diagnózis időpontja (0. nap, Dx minta)
• Az első kemoterápia után (C1 időpont)
• A második kemoterápia után (C2 időpont)
• A harmadik kemoterápia után (C3 időpont)

• Relapszus vagy refrakteritás esetén,

  • az első relapszus vagy refrakteritás (RR1) diagnosztizálásakor
  • a második relapszus vagy refrakteritás (RR2) diagnosztizálásakor
• Hosszú távú remissziós kontroll minták a diagnózis után 1, 2, 3 évvel (LTR1, 2, 3)