MIF-Beteiligung an AML (MIFAML)

Die Studie zielt darauf ab, die Beteiligung von MIF an AML bei Erwachsenen zu untersuchen.

1. BESCHREIBUNG DES ELEMENTS ODER DER UNTERSUCHTEN ELEMENTE 1.1. Messung von MIF-Konzentrationen Plasma- und BM-Überstand von Patienten und Kontrollen (100 altersangepasste Kontrollen für Blut und BM-Plasma, erhältlich bei Tours Hospital, ClinicalTrials.gov #NCT02789839 ) werden mittels ELISA analysiert. BM-Überstände werden nach einem zweistufigen Zentrifugationsverfahren erhalten: 1 ml frischer BM von AML-Patienten oder Kontroll-BM wird bei 540 g für 5 min zentrifugiert, um lebensfähige Zellen im Pellet zu gewinnen (für zytometrische und Expressionsstudien); der Überstand wird bei 1000 g/15 min/4°C zentrifugiert, um das Plasma herzustellen. MIF-Konzentrationen in Knochenmark und Blutplasma werden systematisch verglichen. Da die MIF-Konzentrationen von verschiedenen Faktoren beeinflusst werden können, darunter Entzündungen, Leukozytose und Monozytose, werden Blutkörperchenzahlen und C-reaktive Proteinspiegel im Plasma gemessen und bei der Interpretation der Daten berücksichtigt.

1.2. Messung der MIF-, CD74- und CXCR4-Expression Hämatopoetische Stammzellen, Vorläuferzellen und Blasten von AML-Patienten werden nach der Expression von CD34-, CD38-, CD90-, CD45-RA- und IL-3R-Antigenen unter Berücksichtigung des anfänglichen Immunphänotyps sortiert die Krankheit. Hämatopoetische Stammzellen und Vorläuferzellen aus Kontroll-BM-Proben werden ähnlich sortiert. Die MIF-, CD74- und CXCR4-RNA-Expression wird durch quantitative RT-PCR in sortierten Zellsubpopulationen untersucht. Die Oberflächenexpression von CXCR4 und Anti-CD74 sowie intrazellulärem CD74 wird durch multiparametrischen Fluss mit Zytometrie untersucht.

1.3. Analyse von MIF, CD74, CXCR4-Expression und MIF-Konzentrationen zum Zeitpunkt der vollständigen Remission.

Die in a) und b) durchgeführten Analysen werden in Proben mit vollständiger Remission bei 30 bis 50 ausgewählten Patienten wiederholt. Die Patienten werden nach ihrem Ansprechen auf die Therapie (Beurteilung einer vollständigen Remission und normaler Blutbilder) und nach dem Genotyp ihrer Erkrankung ausgewählt (15-25 Patienten mit entweder TET2- oder DNMT3A-Mutationen bei der Diagnose gegenüber 15-25 Patienten ohne diese Mutationen). . Die Proben werden nach zwei Chemotherapiezyklen zum Zeitpunkt der Remissionsbeurteilung entnommen. Wann immer möglich, werden Knochenmarkkontrollen von Patienten in Langzeitremission (> 1 Jahr nach der Diagnose) gesammelt und untersucht. In der Zwischenzeit werden NGS-, ddPCR-, FISH- oder RT-PCR-Techniken verwendet, um die Persistenz oder Abwesenheit der anfänglichen AML-Läsionen zu beurteilen.

Es wird erwartet, dass für 80 % der eingeschlossenen Patienten vollständiges Material erhalten wird, wodurch das Ziel von 240 Patienten in weniger als drei Jahren erreichbar ist. Die Zellreinigung kann im Zusammenhang mit AML mit abweichendem Immunphänotyp ein Problem darstellen: Dies wird durch die Verwendung geeigneter FACS-Protokolle berücksichtigt. Hinsichtlich des Fokus auf den MIF-Weg kann nicht ausgeschlossen werden, dass andere Chemokine/Zytokine oder andere Moleküle an der Kommunikation von AML-Zellen und ihrer Mikroumgebung beteiligt sein können. Daher werden Aliquots von Knochenmark und Blutplasma kryokonserviert, um eine Verfeinerung unserer Strategie zu ermöglichen (z. B. um Zytokin-Arrays, ELISA- oder MS-Analysen durchzuführen, die im Saint-Antoine-Krankenhaus verfügbar sind).

1.4. Xenotransplantationsmodell der primären AML in NSG-Mäusen Xenotransplantationsmodelle primärer AML-Zellen wurden in einer Kohorte von 70 AMLs entwickelt, in denen die MIF-Expression, der zytogenetische und molekulare Genotyp analysiert und diese Parameter mit verschiedenen Transplantationsphänotypen korreliert werden.

1.5. MIF-Hemmung in mit AML-Zellen transplantierten NSG-Mäusen und in NSG-Mäusen, denen TET2-depletierte oder DNMT3A-depletierte Nabelschnurblut-HSPCs transplantiert wurden. In diesen Experimenten werden primäre AML-Patientenzellen von 6 Patienten mit TET2-Mutationen unserer Kohorte, die transplantiert werden, verwendet, um Leukämie zu erzeugen. Wenn eine leukämische Entwicklung im Blut beobachtet wird (zwischen 8 und 10 Wochen), wird die MIF-Expression im Serum von Mäusen gemessen. Die Mäuse werden in drei Gruppen mit 7 Mäusen pro Gruppe randomisiert: Eine Gruppe wird mit einem kommerziell erhältlichen MIF-Inhibitor (ISO-1) und eine zweite Gruppe mit einem Anti-MIF-Antikörper behandelt, und eine Gruppe wird drei Wochen lang mit dem Vehikel behandelt (eine Injektion pro Woche). Die Mäuse werden dann überwacht, um eine präleukämische Transplantation und die AML-Entwicklung anhand wöchentlicher Blutentnahmen und Anti-Human-CD45-Färbung zu erkennen.

Ein Modell der Xenotransplantation durch CD34+-Zellen aus Nabelschnurblut, die mit TET2-shRNAs exprimierenden Lentivektoren transduziert wurden, wurde entwickelt. Diese gentechnisch veränderten CD34-positiven Zellen zeigten eine erhöhte MIF-Expression und -Sekretion und zeigten eine verstärkte Multilinien-NSG-Verpflanzung. II wird getestet, ob die Hemmung von MIF unter Verwendung von MIF-Inhibitor oder Anti-MIF-Antikörper zu einer Korrektur der verstärkten Multilinien-NSG-Verpflanzung durch TET2-depletierte Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen führt. Ähnliche Experimente werden mit einem DNMT3A-abgereicherten Modell unter Verwendung von DNMT3A-shRNAs durchgeführt, die derzeit im Labor verfügbar sind. Darüber hinaus werden die Wirkungen der MIF-Hemmung (Inhibitor und Antikörper) und rekombinanter menschlicher MIF in NSG-Repopulationsassays an unverarbeiteten CD34+-Zellen aus normalem Nabelschnurblut analysiert.

1.6. MIF-Hemmung in NSG-Mäusen, die mit Zellen von Patienten in vollständiger Remission mit persistierender klonaler Hämatopoese (DNMT3A/TET2-Mutante) transplantiert wurden Proben vollständiger Remission von sechs Patienten mit persistierender klonaler Hämatopoese in vollständiger Remission werden ausgewählt und wie in a) behandelt, um zu testen, ob MIF-Hemmung vorliegt ist auch in der Lage, der NSG-Repopulation durch verbleibende präleukämische Stammzellen entgegenzuwirken.

Es wird erwartet, dass die MIF-Hemmung die AML-Entwicklung bei Mäusen beeinträchtigt. Stabilität und Nebenwirkungen von Anti-MIF-Antikörpern oder -Inhibitoren können jedoch bei behandelten Tieren ein Problem darstellen. In diesem Fall werden shRNAs verwendet, um MIF in AML-Zellen vor der Injektion in NSG-Mäuse abzubauen. Ein weiteres Problem kann die Notwendigkeit einer Co-Injektion von MSCs zum Zeitpunkt der Xenotransplantation sein, um die Relevanz des Modells zu erhöhen. Bei Bedarf werden normale MSCs und AML-MSCs gesammelt, präpariert und zusammen mit AML-Zellen injiziert.

1.7. Vollständige Charakterisierung der Hochregulierung von MIF in TET2-depletierten Zellen Wie TET2 die Genregulation beeinflussen könnte, ist immer noch nicht vollständig geklärt. Kürzlich hat das Team von Cao X gezeigt, dass der Verlust von Tet2 zur Hochregulierung mehrerer Entzündungsmediatoren führte. In diesem Modell rekrutierte Tet2 Hdac2 und unterdrückte die Transkription von Il6 über Histon-Deacetylierung. Es wurde festgestellt, dass TET2 den proximalen Promotor des MIF-Gens bindet, das in Kasumi-Zellen mit CpG-Inseln angereichert ist. Der Verlust von TET2 führt zu einer MIF-Akkumulation in mehreren Leukämiemodellen durch EGR1. i) Die Methylierung des MIF-Promotors wird durch Sequenzierung nach Bisulfitbehandlung in normalen CD34+-Zellen (20 Proben) und Zellpopulationen aus AMLs, sortiert wie in c) (150 Proben) analysiert. ii) Die EGR1-mRNA-Expression wird durch qRT-PCR in normalen und Präleukämische AML-Stammzellen, um festzustellen, ob eine Korrelation mit der MIF-Expression besteht, wie in anderen Modellen beobachtet. iii) ChIP-PCR-Analysen mit Schwerpunkt auf dem MIF-Promotor werden für EGR1, H3K4me3, H3K27me3 und HDAC2 in Kontroll- und AML-Patientenproben durchgeführt. Wenn EGR1 nicht an diesem System beteiligt ist, wird der MIF-Promotor-Luciferase-Assay verwendet, um Transkriptionsfaktorstellen zu identifizieren, die für seine Hochregulierung in AML-Proben wesentlich sind, und die Ziele durch ChIP-PCR zu validieren. All diese Technologien sind verfügbar.

1.8. Bidirektionale Kommunikation zwischen MSCs und AML-Zellen oder normalen HSPCs Der Einfluss der MIF-Überexpression in AML-Zellen wird auf die Physiologie normaler MSCs getestet (Differenzierung, Aufrechterhaltung der Hämatopoese, Produktion von Zytokinen / Chemokinen, Interaktom). Zu diesem Zweck werden normale primäre MSCs aus adultem Knochenmark (bereits verfügbar) isoliert und wie beschrieben expandiert (Reinisch A et al, Blood 2015, 125:249-260). Die Zellen werden bis zu Passage 2 (P2) amplifiziert. MSCs werden mit unterschiedlichen Konzentrationen von rekombinantem MIF für 24 und 48 Stunden behandelt und die Proliferation, Produktion von Zytokinen/Chemokinen wird bewertet. Da berichtet wurde, dass MIF die Glykolyse stimuliert, werden die Wirkungen von MIF auch im energetischen Stoffwechsel von MSCs entschlüsselt, indem die mitochondriale Atmung und Glykolyse von MSCs gemessen werden (Seahorse XF extrazellulärer Flussanalysator) und durch Bestimmung ihres MIF-induzierten Stoffwechsels Signatur mit Hochdurchsatz-Multiplex-Fingerprinting (Omnilog Biolog). Um die Auswirkungen der MIF-Überexpression durch AML-Zellen zu modellieren, werden Kokulturexperimente zwischen menschlichen primären AML-Zellen (5 Proben) durchgeführt, die MIF exprimieren oder nicht (shRNA). Nach 24 und 48 Stunden werden MSCs sortiert und ihr Proliferations-, Zellzyklus- und Differenzierungspotenzial in Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten bewertet. Frühere Studien weisen darauf hin, dass MIF-CXCR4 eine neue Achse für die MSC-Rekrutierung in Tumoren in vivo ist.

Daher wird untersucht, ob rekombinantes MIF MSCs unter Verwendung von In-vitro-Transwell-Assays rekrutieren kann. Die Wirkung der MIF-Produktion durch AML-Zellen auf die Rekrutierung von MSCs wird unter Verwendung von AML-konditioniertem Medium getestet. In diesem Zusammenhang werden mit MIF-shRNA konstruierte AML-Zellen verwendet. Da nicht ausgeschlossen werden kann, dass MSCs auch zur MIF-Produktion beitragen, wird die mRNA-Expression durch primäre normale MSC getestet, die mit AML-Zellen kokultiviert werden.

Es wird erwartet, dass rekombinantes MIF entweder die Proliferation, den Zellzyklus, das Differenzierungspotential oder die Migration von MSCs beeinflusst. Allerdings könnte MIF, das in der BM-Mikroumgebung produziert wird, auch die Biologie anderer Populationen der Stammzellnische modifizieren, einschließlich Osteoblasten, Endothelzellen oder Makrophagen. Um alternative Zellen zu untersuchen, auf die MIF einen Einfluss haben könnte, wird es seine Auswirkungen auf diese Populationen testen. MSCs werden induziert, um sich in Osteoblasten, Adipozyten oder Chondrozyten zu differenzieren. Anschließend wird MIF hinzugefügt, um die Proliferation, den Zellzyklus und die Migration der interessierenden Populationen zu untersuchen. Die Wirkung auf Osteoblasten und Endothelzellen wird unter Verwendung von MG63- bzw. Huvec-Zelllinien modelliert.

1.9. Studienpopulation 1.9.1. Rekrutierung von Teilnehmern 300 erwachsene Patienten (>18), bei denen AML neu diagnostiziert wurde, werden in die Studie aufgenommen. 85 Patienten, die seit November 2015 im Saint-Antoine Hospital diagnostiziert wurden, werden rückwirkend in die Studie aufgenommen. 215 neu diagnostizierte AML-Patienten in den Universitätskliniken Saint-Antoine und Tours werden prospektiv aufgenommen [>100 AML-Patienten pro Jahr werden an das Saint-Antoine-Krankenhaus (>70 Patienten pro Jahr) und das Tours University Hospital für AML (>30 Patienten pro Jahr) überwiesen Jahr)].

1.9.2. Teilnehmer-Follow-up

Entnahme von Patientenproben:

In der Studie werden nur standardmäßige Blut- und Knochenmarkproben verwendet:

• Blutproben für Biochemie, Blutzellzählungen, Immunphänotypisierung, Zytogenetik, molekularbiologische Analysen und Kryokonservierung von Tumorbanken
• Knochenmarkproben für Immunphänotypisierung, Zytogenetik, molekularbiologische Analysen und Kryokonservierung von Tumorbanken

Zeitpunkte:

Es werden nur Proben zum Standardpflegezeitpunkt erhoben:

• Diagnosezeitpunkt (Tag 0, Dx-Probe)
• Nach der ersten Chemotherapie (Zeitpunkt C1)
• Nach dem zweiten Chemotherapiezyklus (C2-Zeitpunkt)
• Nach dem dritten Chemotherapiezyklus (C3-Zeitpunkt)

• Bei Rückfall oder Refraktärität,

  • zum Zeitpunkt der Diagnose des ersten Rückfalls oder der Refraktärität (RR1)
  • zum Zeitpunkt der Diagnose eines zweiten Rückfalls oder Refraktärität (RR2)
• Langzeit-Remissionskontrollproben 1, 2, 3 Jahre nach Diagnose (LTR1, 2, 3)