微生物性角膜炎における角膜のマイクロバイオームの調査 (STOICA)

微生物性角膜炎 (MK) は、角膜瘢痕、穿孔、眼内炎、最終的には失明など、視力を脅かす合併症につながる可能性がある眼科の緊急事態です。 患者は、積極的な局所抗菌薬療法と綿密な治療反応のモニタリングを必要とし、多くの場合、入院とその後の頻繁な外来通院が含まれます。

転帰の改善は、原因微生物を迅速に特定することにかかっています。 現在、原因と思われる微生物は、従来のスクレイピング法と標準的な従来の診断培養法 (CDC) を使用して約 30 ～ 40% の症例でしか分離されておらず、臨床医が結果を入手できるようになるまでに通常 4 日ほどかかります。 微生物標的ポリメラーゼ連鎖反応 (MTPCR) やメタゲノム解析などのより感度の高い方法は、微生物を検出する可能性を高めますが、共生微生物を拾う可能性を高める可能性があり、治療を行う臨床医が分離された生物のうちどれが検出する可能性が高いかを解釈することを困難にします。 MKで原因となります。

微生物を特定する際の障壁の 1 つは、角膜からのサンプルの収集が困難なことです。 2015 年、リバプール大学の Kaye 教授が率いるグループは、ポリテトラフルオロエチレン製の角膜印象膜 (CIM) を使用した非侵襲的な角膜サンプリング方法を開発しました。 これは、従来のスクレイピング方法と比較して、全体的な分離率が大幅に高いことが示されました。 低侵襲であるため、CIM サンプリング法は、MK を呈している患者の影響を受けた角膜と影響を受けていない角膜の両方、および MK の影響を受けていない患者の眼をサンプリングするユニークな機会を提供します。 これにより、MK で分離された生物の臨床的意義をよりよく理解できるようになります。

メタゲノム次世代シーケンス (NGS) 技術により、サンプル中のすべての微生物のゲノム解析が可能になり、微生物の存在と相互作用、および抗菌薬耐性 (AMR) 遺伝子の有無に関する豊富な情報が得られます。 メタゲノミクスを使用して健康な眼表面マイクロバイオームを特徴付けようとする以前の研究では、多様な常在恒常性マイクロバイオームが実証されましたが、角膜ではなく眼瞼、結膜、および涙から採取されたスワブに限定されていました。 マイクロバイオームの変動は、ドライアイ症候群、コンタクト レンズの着用、シュードモナス属菌が優勢な病理学的マイクロバイオームを含む感染症などの状態に関連しています。細菌性角膜炎の少数の患者で。 角膜は MK の影響を受ける表面ですが、従来のサンプリング方法は侵襲的であるため、健康な角膜マイクロバイオームに関するデータはありません。

NGS は数時間でパーソナライズされた結果を生成しますが、臨床的意義を理解せずに存在するすべての生物を検出する感度は、臨床診療への導入の障壁です。 このプロジェクトでは、CIM サンプリング法と NGS 処理を使用して、MK の原因生物の理解を深めます。 さらに、MK患者の罹患した眼と罹患していない眼の両方、およびMKのない眼からサンプリングすることにより、共生生物を特定して割り引くための診断規則が開発されます。 さまざまな対照群を含めることで、MK の発生と治療の両方に関与するマイクロバイオームに対するコンタクト レンズと点眼薬の影響に関する情報も得られます。 これにより、角膜サンプルの結果の現在の解釈が大幅に容易になり、日常的な眼科臨床診療における NGS の潜在的な将来の使用が促進されます。

目的と目的

このプロジェクトの全体的な目的は、健康と疾患における角膜マイクロバイオームをよりよく理解することにより、MK 患者の病原性微生物をより正確に定義することです。

これは、以下の目的を通じて達成されます。

1. NGS を使用して、MK のある患者とない患者の罹患眼と非罹患眼の角膜マイクロバイオームを分析し、CDC および MTPCR からの同時結果と比較します。
2. MK 患者、健常者、コンタクト レンズ装用者、点眼薬使用者の角膜、眼球表面、隣接構造の微生物スペクトルを測定します。

研究デザイン:

設計: 前向き観察診断研究および方法比較。

学習期間: 3 年間。

科目の数と種類:

MKの151人の患者が募集されます。 これは、次のサンプル サイズの計算に基づいています。 現在の標準的な診断参照法 (CDM) の診断精度は 40% です。 NGS を臨床に実装するには、診断精度を少なくとも 80% まで高める必要があります。 NGS は、検出された微生物の割合を増やすことしかできません。 95% の信頼区間 (幅 15%) で 80% の診断率を推定するには、137 人の参加者が必要です。 この計算では、最小の診断グループの有病率が 20% であると想定しています。 フォローアップが失われる可能性がある 10% の割合を調整するために、151 人の患者を募集します。

また、90 人の参加者を 4 つの対照グループに募集します。

1. 点眼薬を使用していない MK の病歴のない患者 20 人
2. コンタクトレンズ装用者でMKの病歴のない20人の患者
3. MKの既往歴はないが、緑内障で点眼治療を受けている20人の患者。 このグループは、治療を中止した場合に二次的な角膜マイクロバイオームの変化を評価するために含まれています。
4. クロスリンキングを受けている円錐角膜の 30 人の患者が募集されます。 これらの参加者は、定期的な架橋手順の一環として、角膜上皮が除去されます。 そうでなければ健康な角膜表面から上皮を除去することで、CIM から特徴付けられた角膜マイクロバイオームと、上皮から直接特徴付けられた角膜マイクロバイオームとの直接比較が可能になります。

臨床データ収集

プレゼンテーションでは、患者の人口統計、危険因子（眼表面疾患、コンタクトレンズの着用、以前のMK）、および過去に受けた治療またはプレゼンテーションで使用した治療が、潰瘍の特徴（角膜潰瘍の長軸および短軸）とともにインタビューから取得されます。連続スケールを使用して測定されます)。 標準化されたデータ収集フォームが利用されます。

細隙灯生体顕微鏡を使用して、潰瘍の最良矯正視力（BCVA）、サイズ、位置、および深さを記録します。 潰瘍のサイズ (短軸と長軸) と位置 (輪部からの最小距離) が測定されます。 潰瘍の深さは、潰瘍の下に残っている角膜の厚さのパーセンテージに基づいて、1 ～ 4 の公称スケールで測定されます。

標本収集

参加者ごとに、次のサンプルが収集されます。

• MKの参加者の影響を受けた目と影響を受けていない目、またはコントロール参加者の片目からの3つのCIM。
• 参加者の影響を受けた目と影響を受けていない目、上まぶたと鼻の結膜からの綿棒。

滅菌手袋を使用して、角膜の表面に 3 つの CIM (PTFE ミリポア カルチャー インサート、孔径 0.40 マイクロメートル) を 5 秒間、1 つの CIM を参加者の下円蓋結膜に 5 秒間適用します。 局所麻酔薬 (0.5% プロキシメタカイン 1 滴) は、CIM を適用する前に結膜円蓋下部に注入されます。 参加者の角膜から得られた最初の CIM サンプルは、培養用の 0.5 mL の BHI ブイヨンを含むボトルに入れられ、輸送されます。 参加者の角膜と下結膜から得られた CIM は、滅菌チューブで乾燥した状態に保たれます。 記載されているサンプルの収集に加えて、角膜架橋を受けている患者から摘出された角膜上皮は、滅菌エッペンドルフに配置され、-80 C で保存されます。スワブは、参加者の結膜、上まぶた、および前鼻孔から順番に採取されます。周囲のマイクロバイオームと内因性ソースを特徴付けます。

MK参加者のフォローアップ

臨床的に疑われる MK を提示する参加者は、MK のフォローアップの通常の手順に従って、提示後 3 日、7 日、および 1 か月でフォローアップされます。 各フォローアップ予定のBCVAで、潰瘍のサイズと深さが記録されます。 すべてのサンプルは、参加者の影響を受けた目のみから、各フォローアップの予定で繰り返されます。 これらには、3 つの角膜 CIMS、結膜、上まぶた、および鼻スワブが含まれます。

サンプルの処理と微生物の識別:

1. CDC (確立された診断基準): 血液、チョコレート、サブロース デキストロース寒天プレート、および細菌スワブと膜を接種した BHI ブロスの 24 時間継代培養を、24 時間および 48 時間のインキュベーション後に細菌増殖の証拠について調べます。
2. MTPCR: CIM およびウイルス結膜スワブから DNA を抽出して定量化します。 HSV-1、HSV2、アカントアメーバ、16S および 18S リボソーム DNA のプライマーを含むマルチプレックス微生物ターゲット PCR (MTPCR) マスター ミックスを調製し、リアルタイム PCR 装置を使用して PCR を行います。
3. NGS: イルミナ HiSeq 4000 などのハイスループット プラットフォームを使用して、メタゲノム検査を実施します。 シーケンシングの深さは経験的に決定されます。 確立されたパイプラインを使用して、ゲノムのアライメント、フィルタリング、および病原体の呼び出しが実行されます。 分類学的分類には、読み取り分類に基づく分析アプローチが適用されます。 ホスト DNA と健康なコントロールの目のメタゲノムの除去に基づくサブトラクティブ分析法が適用されます。

統計分析：

MK角膜サンプルのCDC、MTPCR、およびNGS処理から得られた分離率と同定された細菌の比較が行われます。 これは、ベン図を使用して視覚化されます。

NGS データについては、Center of Genomic Research (CGR) と協力して分類ラベルを割り当て、各サンプルの相対存在量を計算します。 AMR の検出のために、ソフトウェアを使用して読み取りを包括的な AMR データベース内の読み取りに直接マッピングし、存在する AMR 遺伝子を報告します。

次に、MK を持つ眼で識別された微生物を、対照の仲間の眼および他の対照群と比較し、健康な角膜マイクロバイオームで見られるものと比較して、最も可能性の高い病原性微生物を識別するために適用される減法バイオインフォマティクスの方法論を適用します。

参加者のフォローアップ訪問で MK 角膜サンプルから得られた微生物の相対的存在量の比較を使用して、MK の治療および解消中の角膜マイクロバイオームの縦方向の変化を評価します。

参加者の角膜、結膜、まぶた、鼻から分離された微生物の相対存在量を直接比較して、MK の内因性感染源の可能性を特定します。 サンプル サイト間の微生物の重複は、ベン図とサンプル サイト間の違いを評価するために使用されるノンパラメトリック テストを使用して視覚化されます。