Sarveiskalvon mikrobiomin tutkiminen mikrobien keratiitissa (STOICA)

Mikrobien keratiitti (MK) on silmätauti, joka voi johtaa näköä uhkaaviin komplikaatioihin, kuten sarveiskalvon arpeutumiseen, perforaatioon, endoftalmiittiin ja lopulta sokeuteen. Potilas tarvitsee aggressiivista paikallista antimikrobista hoitoa ja tarkkaa hoitovasteen seurantaa, johon sisältyy usein sairaalahoitoa, jota seuraa toistuvia avohoitokäyntejä.

Tulosten paraneminen riippuu aiheuttavan mikro-organismin nopeasta tunnistamisesta. Tällä hetkellä todennäköinen aiheuttava mikro-organismi eristetään vain noin 30–40 %:ssa tapauksista perinteisiä kaavintamenetelmiä ja tavanomaista tavanomaista diagnostista viljelmää (CDC) käyttäen, ja tulosten saaminen kliinikon saataville kestää tyypillisesti 4 päivää. Herkemmät menetelmät, kuten mikro-organismeihin kohdistettu polymeraasiketjureaktio (MTPCR) ja metagenominen analyysi lisäävät mahdollisuuksia havaita mikro-organismeja, mutta voivat lisätä todennäköisyyttä poimia kommensaalisia mikro-organismeja, jolloin hoitavan lääkärin on vaikea tulkita, mitkä eristetyistä organismeista todennäköisesti olla aiheuttaja MK:ssa.

Yksi organismien tunnistamisen esteistä on ollut vaikeus kerätä näytteitä sarveiskalvosta. Vuonna 2015 Liverpoolin yliopiston professori Kayen johtama ryhmä kehitti noninvasiivisen sarveiskalvonäytteenottomenetelmän käyttämällä polytetrafluorietyleenistä valmistettua sarveiskalvon jäljennöskalvoa (CIM). Tällä osoitettiin olevan huomattavasti suurempi yleinen eristysaste verrattuna tavanomaisiin kaavintamenetelmiin. Koska CIM-näytteenottomenetelmä on minimaalisesti invasiivinen, se tarjoaa ainutlaatuisen mahdollisuuden ottaa näytteitä sekä sairastuneesta sarveiskalvosta että vahingoittumattomasta sarveiskalvosta potilailla, joilla on MK, sekä sellaisten potilaiden silmistä, joilla ei ole MK:ta. Tämä mahdollistaa paljon paremman ymmärryksen eristettyjen organismien kliinisestä merkityksestä MK:ssa.

Metagenomiset seuraavan sukupolven sekvensointitekniikat (NGS) mahdollistavat kaikkien näytteessä olevien mikrobien genomisen analyysin, mikä antaa runsaasti tietoa mikro-organismien läsnäolosta ja vuorovaikutuksesta sekä antimikrobiaaliresistenssigeenien (AMR) olemassaolosta tai puuttumisesta. Aiemmat tutkimukset, joissa yritettiin karakterisoida silmän pinnan mikrobiomia terveydessä metagenomiikan avulla, ovat osoittaneet, että homeostaattinen mikrobiomi on monipuolinen, mutta ne ovat kuitenkin rajoittuneet kannesta, sidekalvosta ja kyynelistä otettuihin vanupuikoihin sarveiskalvon sijaan. Mikrobiomin vaihtelut on liitetty tiloihin, kuten kuivasilmäisyyteen, piilolinssien kulumiseen ja tarttuviin patologioihin, mukaan lukien patologinen mikrobiomi, jota hallitsevat pseudomonas spp. pienellä määrällä potilaita, joilla on bakteeriperäinen keratiitti. Huolimatta siitä, että sarveiskalvo on MK:n vaikutusalue, terveestä sarveiskalvon mikrobiomista ei ole tietoa, koska perinteiset näytteenottomenetelmät ovat olleet invasiivisia.

Huolimatta siitä, että NGS tuottaa henkilökohtaisia ​​tuloksia muutamassa tunnissa, sen herkkyys havaita kaikki läsnä olevat organismit ymmärtämättä niiden kliinistä merkitystä on este sen käyttöönotolle kliiniseen käytäntöön. Tässä projektissa käytetään CIM-näytteenottomenetelmää ja NGS-käsittelyä parantamaan ymmärrystä MK:n aiheuttajista organismeista. Lisäksi ottamalla näytteitä MK-potilaiden sairaista ja vahingoittumattomista silmistä ja niistä, joilla ei ole MK:ta, kehitetään diagnostinen sääntö kommensaalisten organismien tunnistamiseksi ja poissulkemiseksi. Erilaisten kontrolliryhmien sisällyttäminen antaa tietoa myös piilolinssien ja silmätippojen vaikutuksesta mikrobiomiin, joilla on merkitystä sekä MK:n kehittymisessä että hoidossa. Tämä helpottaa suuresti sarveiskalvonäytetulosten nykyistä tulkintaa ja mahdollistaa NGS:n tulevan käytön rutiininomaisessa oftalmologisessa kliinisessä käytännössä.

Päämäärät ja tavoitteet

Hankkeen yleisenä tavoitteena on määritellä paremmin MK-potilaiden patogeeniset mikro-organismit ymmärtämällä paremmin sarveiskalvon mikrobiomia terveydessä ja sairaudessa.

Tämä saavutetaan seuraavien tavoitteiden avulla.

1. Analysoi NGS:n avulla sairaan ja sairaan silmän sarveiskalvon mikrobiomi potilailla, joilla on tai ei ole MK:ta, ja vertaa niitä samanaikaisiin CDC- ja MTPCR-tuloksiin.
2. Selvitä sarveiskalvon, silmän pinnan ja vierekkäisten rakenteiden mikrobiologinen spektri MK-potilailla, terveillä kontrolleilla, piilolinssien käyttäjillä ja silmätippojen käyttäjillä.

Opintosuunnitelma:

Suunnittelu: Prospektiivinen havainnollinen diagnostinen tutkimus ja menetelmien vertailu.

Opintojen kesto: Kolme vuotta.

Aiheiden lukumäärä ja tyyppi:

Rekrytoidaan 151 MK-potilasta. Tämä perustuu seuraavaan otoskoon laskelmaan: Nykyisen standardin diagnostisen vertailumenetelmän (CDM) diagnostinen tarkkuus on 40 %. NGS:n kliinisessä toteutuksessa diagnostisen tarkkuuden on nostettava vähintään 80 prosenttiin. NGS voi vain lisätä havaittujen mikro-organismien osuutta. 80 %:n diagnostisen osuuden arvioimiseksi 95 %:n luottamusvälillä (leveys 15 %) tarvitaan 137 osallistujaa. Tässä laskelmassa oletetaan, että pienimmän diagnostisen ryhmän esiintyvyys on 20 %. Ottaaksemme huomioon 10 %:n mahdollisen seurannan menetyksen, rekrytoimme 151 potilasta.

Rekrytoimme myös 90 osallistujaa neljään kontrolliryhmään:

1. 20 potilasta, joilla ei ole ollut MK:ta ja jotka eivät käytä silmätippalääkitystä
2. 20 potilasta, joilla ei ole ollut MK:ta ja jotka käyttävät piilolinssejä
3. 20 potilasta, joilla ei ole aiemmin ollut MK:ta, mutta he saavat silmätippahoitoa glaukoomaan. Tämä ryhmä on otettu mukaan arvioimaan sarveiskalvon mikrobiomissa tapahtuvia muutoksia, jotka voivat olla toissijaisia ​​tiputushoidon seurauksena.
4. Rekrytoidaan 30 potilasta, joilla on keratoconus ja joille tehdään silloittumista. Näiltä osallistujilta osana rutiininomaista silloitusmenettelyä poistetaan sarveiskalvon epiteeli. Tämä poistettu epiteeli muuten terveestä sarveiskalvon pinnasta mahdollistaa suoran vertailun sarveiskalvon mikrobiomin välillä, jotka on karakterisoitu CIM:stä ja epiteelistä suoraan karakterisoituun.

Kliinisen tiedon kerääminen

Esittelyssä haastattelusta saadaan potilaan demografiset tiedot, riskitekijät (silmän pintasairaus, piilolinssien kuluminen, aiempi MK) ja aiemmin saatu tai esittelyssä käytetty hoito sekä haavan ominaisuudet (sarveiskalvon haavan pää- ja sivuakselit mitattuna jatkuvalla asteikolla). Käytetään standardoitua tiedonkeruulomaketta.

Paras korjattu näöntarkkuus (BCVA), haavan koko, sijainti ja syvyys tallennetaan rakolampun biomikroskoopilla. Haavan koko (pieni- ja pääakselit) ja sijainti (minimietäisyys limbuksesta) mitataan. Haavan syvyys mitataan nimellisasteikolla 1-4, joka perustuu haavan alla jäljellä olevan sarveiskalvon paksuuden prosenttiosuuteen.

Näytteiden kokoelma

Jokaiselta osallistujalta kerätään seuraavat näytteet:

• Kolme CIM:ää MK-potilaiden sairastuneista ja vahingoittumattomista silmistä tai kontrolliosallistujien yhdestä silmästä.
• Pyyhkäisynäytteet osallistujan sairaiden ja vahingoittumattomien silmien sidekalvosta, yläluomesta ja nenästä.

Kolme CIM:ää (PTFE Millipore -viljelyinsertti, huokoskoko 0,40 mikrometriä) levitetään sarveiskalvon pinnalle 5 sekunniksi ja yksi CIM osallistujille steriileillä käsineillä 5 sekunniksi inferior fornix conjunctivalle. Paikallinen anestesia (yksi tippa 0,5-prosenttista proksimetakiinia) tiputetaan sidekalvon alaosaan ennen CIM-lääkkeiden käyttöä. Ensimmäinen osallistujien sarveiskalvosta saatu CIM-näyte asetetaan ja kuljetetaan pullossa, joka sisältää 0,5 ml BHI-lientä viljelyä varten. Osallistujien sarveiskalvosta ja alemmasta sidekalvosta saadut CIM:t pidetään kuivina steriilissä putkessa. Kuvatun näytekeräyksen lisäksi potilailta, joille sarveiskalvon silloittaminen on tehty, poistettu sarveiskalvon epiteeli sijoitetaan steriiliin eppendorfiin ja säilytetään -80 C:ssa. Pyyhkäisynäytteet otetaan osanottajan sidekalvosta, ylemmästä silmäluomista ja etummaisista naruista järjestyksessä. kuvaamaan ympäröivää mikrobiomia ja endogeenisiä lähteitä.

MK-osallistujan seuranta

Osallistujia, joilla on kliinisesti epäilty MK, seurataan 3 päivän, 7 päivän ja 1 kuukauden kuluttua esittelystä normaalin MK-seurantamenettelyn mukaisesti. Jokaisella seurantakäynnillä BCVA, haavan koko ja syvyys kirjataan. Kaikki näytteet toistetaan jokaisella seurantakäynnillä vain osallistujilta, joiden silmät ovat sairastuneet. Näihin kuuluu kolme sarveiskalvon CIMS:ää, sidekalvon, ylemmän silmäluomen ja nenän vanupuikkoa.

Näytteiden käsittely ja mikro-organismien tunnistaminen:

1. CDC (vakiintunut diagnostinen standardi): Veri, suklaa ja Sabouraud'n dekstroosiagar-maljat ja 24 tunnin jatkoviljelmä BHI-liemestä, johon on siirrostettu bakteeripyyhkäisyillä ja -kalvoilla, tutkitaan todisteita bakteerien kasvusta 24 ja 48 tunnin inkubaation jälkeen.
2. MTPCR:DNA uutetaan ja kvantifioidaan CIM- ja virologian sidekalvon vanupuikoista. Multipleksi mikro-organismeihin kohdistettu PCR (MTPCR) -perusseos, joka sisältää HSV-1:n, HSV2:n, acanthamoeban, 16S- ja 18S-ribosomaalisen DNA:n alukkeet, valmistetaan ja PCR suoritetaan käyttäen reaaliaikaista PCR-laitetta.
3. NGS: Metagenominen testaus suoritetaan käyttämällä korkean suorituskyvyn alustoja, kuten Illumina HiSeq 4000. Sekvensointisyvyys määritetään empiirisesti. Genomilinjaukset, suodatus ja patogeenien kutsuminen suoritetaan vakiintuneiden putkien avulla. Taksonomiseen luokitukseen sovelletaan lukuluokitukseen perustuvaa analyysimenetelmää. Sovelletaan subtrektiivista analyysimenetelmää, joka perustuu isäntä-DNA:n ja terveen kontrollisilmän metagenomin poistamiseen.

Tilastollinen analyysi:

MK-sarveiskalvonäytteiden CDC-, MTPCR- ja NGS-käsittelystä saatujen eristysnopeuksien ja tunnistettujen bakteerien vertailu tehdään. Tämä visualisoidaan käyttämällä Venn-kaaviota.

NGS-tietojen osalta teemme yhteistyötä Genomic Researchin (CGR) kanssa taksonomiatunnisteiden määrittämiseksi ja suhteellisen runsauden laskemiseksi kussakin näytteessä. AMR:n havaitsemiseen käytetään ohjelmistoa, joka kartoitetaan suoraan kattavassa AMR-tietokannassa oleviin lukemiin ja raportoidakseen läsnä olevat AMR-geenit.

Mikro-organismeja, jotka on tunnistettu silmissä MK:lla, verrataan sitten verrokkisilmään ja muihin kontrolliryhmiin ja vähennetään bioinformatiikan metodologiaa, jota sovelletaan todennäköisimpien patogeenisten organismien tunnistamiseen verrattuna terveen sarveiskalvon mikrobiomiin.

Sarveiskalvon MK-näytteistä saatujen mikro-organismien suhteellisen runsauden vertailua osallistujien seurantakäynneillä käytetään arvioimaan pitkittäisiä muutoksia sarveiskalvon mikrobiomissa hoidon ja MK:n erottelun aikana.

Osallistujien sarveiskalvosta, sidekalvosta, silmäluomista ja nenästä eristettyjen mikro-organismien suhteellista runsautta verrataan suoraan MK:n mahdollisten endogeenisten infektiolähteiden tunnistamiseksi. Mikro-organismien päällekkäisyydet näytepaikkojen välillä visualisoidaan käyttämällä Venn-diagrammia ja ei-parametrisia testejä, joita käytetään arvioimaan eroja näytepaikkojen välillä.