Исследование микробиома роговицы при микробном кератите (STOICA)

Микробный кератит (МК) является неотложной офтальмологической ситуацией, которая может привести к угрожающим зрению осложнениям, таким как рубцевание роговицы, перфорация, эндофтальмит и, в конечном итоге, к слепоте. Пациенту требуется агрессивная местная антимикробная терапия и тщательный мониторинг ответа на лечение, часто включая госпитализацию с последующими частыми амбулаторными визитами.

Улучшение результатов зависит от быстрой идентификации возбудителя. В настоящее время вероятный возбудитель микроорганизма выделяют только примерно в 30–40% случаев с использованием традиционных методов соскоба и стандартной традиционной диагностической культуры (CDC), при этом результаты обычно становятся доступными для клинициста в течение 4 дней. Более чувствительные методы, такие как полимеразная цепная реакция, нацеленная на микроорганизмы (MTPCR) и метагеномный анализ, увеличивают потенциал обнаружения микроорганизмов, но могут увеличить вероятность обнаружения комменсальных микроорганизмов, что затрудняет для лечащего врача интерпретацию того, какой из выделенных организмов, вероятно, быть каузативным в МК.

Одним из препятствий для идентификации организмов была сложность сбора образцов с роговицы. В 2015 году группа под руководством профессора Кея из Ливерпульского университета разработала методологию неинвазивного забора проб роговицы с использованием оттискной мембраны роговицы (CIM), изготовленной из политетрафторэтилена. Было показано, что это дает значительно более высокую общую скорость выделения по сравнению с обычными методами соскабливания. Будучи минимально инвазивным, метод отбора образцов CIM предлагает уникальную возможность взять образцы как пораженной, так и непораженной роговицы пациентов с МК, а также глаз пациентов, не пораженных МК. Это позволит лучше понять клиническое значение изолированных организмов при МК.

Методы метагеномного секвенирования следующего поколения (NGS) позволяют проводить геномный анализ всех микробов в образце, предоставляя обширную информацию о присутствии и взаимодействии микроорганизмов, а также о наличии или отсутствии генов устойчивости к противомикробным препаратам (AMR). Предыдущие исследования, пытавшиеся охарактеризовать микробиом поверхности глаза в здоровом состоянии с использованием метагеномики, продемонстрировали разнообразный резидентный гомеостатический микробиом, однако они были ограничены мазками, взятыми с века, конъюнктивы и слез, а не с роговицы. Изменения в микробиоме были связаны с такими состояниями, как синдром сухого глаза, ношение контактных линз и инфекционные патологии, включая патологический микробиом, в котором преобладают виды pseudomonas. у небольшого числа пациентов с бактериальным кератитом. Несмотря на то, что роговица является поверхностью, пораженной МК, нет данных о здоровом микробиоме роговицы, поскольку традиционные методы взятия проб были инвазивными.

Несмотря на то, что NGS дает персонализированные результаты в течение нескольких часов, его чувствительность к обнаружению всех присутствующих организмов без понимания их клинического значения является препятствием для его внедрения в клиническую практику. В этом проекте метод отбора проб CIM и обработка NGS будут использоваться для улучшения понимания возбудителей в МК. Кроме того, путем отбора образцов как пораженных, так и здоровых глаз пациентов с МК и пациентов без МК будет разработано диагностическое правило для выявления и исключения комменсальных организмов. Включение различных контрольных групп также предоставит информацию о влиянии контактных линз и глазных капель на микробиом, которые играют роль как в развитии, так и в лечении МК. Это значительно облегчит текущую интерпретацию результатов образцов роговицы и облегчит потенциальное будущее использование NGS в обычной офтальмологической клинической практике.

Цели и задачи

Общая цель проекта — лучше определить патогенные микроорганизмы у пациентов с МК за счет лучшего понимания микробиома роговицы в норме и при патологии.

Это будет достигнуто за счет следующих целей.

1. Используя NGS, проанализируйте микробиом роговицы пораженного и непораженного глаза пациентов с МК и без него и сравните с одновременными результатами CDC и MTPCR.
2. Определить микробиологический спектр роговицы, глазной поверхности и прилегающих структур у пациентов с МК, здоровых лиц, носящих контактные линзы и пользователей глазных капель.

Дизайн исследования:

Дизайн: Проспективное наблюдательное диагностическое исследование и сравнение методов.

Продолжительность обучения: три года.

Количество и тип предметов:

Будет набран 151 пациент с МК. Это основано на следующем расчете размера выборки: Текущий стандартный диагностический эталонный метод (CDM) имеет диагностическую точность 40%. Для клинического внедрения NGS потребуется повысить точность диагностики не менее чем до 80%. NGS может только увеличить долю обнаруживаемых микроорганизмов. Для оценки диагностической частоты 80% с 95% доверительным интервалом (шириной 15%) требуется 137 участников. Этот расчет предполагает, что самая маленькая диагностическая группа имеет распространенность 20%. Чтобы скорректировать 10%-й уровень возможной потери наблюдения, мы наберем 151 пациента.

Мы также наберем 90 участников в четыре контрольные группы:

1. 20 пациентов без МК в анамнезе, которые не используют глазные капли
2. 20 пациентов без МК в анамнезе, которые носят контактные линзы.
3. 20 пациентов, не имевших в анамнезе МК, но получающих лечение глазными каплями от глаукомы. Эта группа была включена для оценки изменений в микробиоме роговицы, которые могут быть вторичными по отношению к лечению каплями.
4. Будут набраны 30 пациентов с кератоконусом, которым проводят кросслинкинг. У этих участников в рамках обычной процедуры перекрестного связывания будет удален эпителий роговицы. Этот удаленный эпителий с поверхности роговицы, в остальном здоровой, позволит провести прямое сравнение микробиома роговицы, охарактеризованного с помощью CIM, и микробиома, охарактеризованного непосредственно из эпителия.

Сбор клинических данных

При поступлении демографические данные пациента, факторы риска (заболевание поверхности глаза, ношение контактных линз, предшествующая МК) и лечение, полученное в прошлом или применявшееся при поступлении, будут получены из интервью вместе с характеристиками язвы (большая и малая оси язвы роговицы). измеряется с помощью непрерывной шкалы). Будет использоваться стандартизированная форма сбора данных.

Острота зрения с максимальной коррекцией (BCVA), размер, расположение и глубина язвы будут регистрироваться с помощью биомикроскопа с щелевой лампой. Будут измеряться размер язвы (по малой и большой осям) и ее расположение (минимальное расстояние от лимба). Глубина язвы будет измеряться по номинальной шкале от 1 до 4 в зависимости от процента оставшейся толщины роговицы под язвой.

Сбор образцов

Для каждого участника будут собраны следующие образцы:

• Три CIM из пораженных и здоровых глаз участников с МК или из одного глаза контрольных участников.
• Мазки с конъюнктивы пораженных и здоровых глаз, верхних век и носа участника.

Три CIM (культуральная вставка PTFE Millipore, размер пор 0,40 микрометра) будут нанесены на поверхность роговицы на 5 секунд и один CIM на нижний свод конъюнктивы участников на 5 секунд с использованием стерильных перчаток. Местный анестетик (одна капля 0,5% проксиметакаина) закапывается в нижний свод конъюнктивы перед применением CIM. Первый образец CIM, полученный из роговицы участников, будет помещен и транспортирован в бутылку, содержащую 0,5 мл бульона BHI для культивирования. CIM, полученные из роговицы и нижней конъюнктивы участников, будут храниться сухими в стерильной пробирке. В дополнение к описанному сбору образцов эпителий роговицы, взятый у пациентов, подвергающихся перекрестному связыванию роговицы, будет помещен в стерильный эппендорф и храниться при температуре -80°C. Мазки будут взяты с конъюнктивы участников, верхних век и передних отделов носа в порядке для характеристики окружающего микробиома и эндогенных источников.

Продолжение участника МК

Участники с клиническим подозрением на МК будут наблюдаться через 3 дня, 7 дней и 1 месяц после поступления в соответствии с обычной процедурой наблюдения за МК. При каждом последующем посещении будут регистрироваться BCVA, размер и глубина язвы. Все образцы будут повторяться при каждом последующем посещении только от участников с пораженным глазом. Они будут включать три CIMS роговицы, конъюнктиву, верхнее веко и носовые мазки.

Обработка проб и идентификация микроорганизмов:

1. CDC (установленный диагностический стандарт): Кровь, шоколад и чашки с декстрозным агаром Сабуро и 24-часовая субкультура бульона BHI, инокулированного бактериальными тампонами и мембранами, будут исследованы на наличие признаков роста бактерий после 24 и 48 часов инкубации.
2. MTPCR: ДНК будет извлечена и количественно определена из CIM и вирусологического мазка с конъюнктивы. Будет подготовлена ​​основная смесь мультиплексной ПЦР, нацеленной на микроорганизмы (MTPCR), включая праймеры для HSV-1, HSV2, акантамебы, 16S и 18S рибосомной ДНК, и ПЦР будет проведена с использованием инструмента для ПЦР в реальном времени.
3. NGS: Метагеномное тестирование будет проводиться с использованием высокопроизводительных платформ, таких как Illumina HiSeq 4000. Глубина секвенирования определяется опытным путем. Выравнивание генома, фильтрация и вызов патогенов будут выполняться с использованием установленных конвейеров. Подход к анализу, основанный на классификации прочтений, будет применяться для таксономической классификации. Будет применяться метод субтрактивного анализа, основанный на удалении ДНК хозяина и метагенома здорового контрольного глаза.

Статистический анализ:

Будет проведено сравнение показателей выделения и идентифицированных бактерий, полученных при обработке CDC, MTPCR и NGS образцов роговицы MK. Это будет визуализировано с помощью диаграммы Венна.

Для данных NGS мы будем работать с Центром геномных исследований (CGR), чтобы присвоить таксономические метки и рассчитать относительную численность в каждом образце. Для обнаружения УПП будет использоваться программное обеспечение для прямого сопоставления прочтений с теми, которые содержатся в обширной базе данных УПП, и сообщения о присутствующих генах УПП.

Затем микроорганизмы, выявленные в глазах с помощью МК, будут сравниваться с контрольным парным глазом и другими контрольными группами, а методология субтрактивной биоинформатики применяется для выявления наиболее вероятных патогенных организмов по сравнению с теми, которые наблюдаются в микробиоме здоровой роговицы.

Сравнение относительного обилия микроорганизмов, полученных из образцов роговицы MK во время последующих посещений участников, будет использоваться для оценки продольных изменений в микробиоме роговицы во время лечения и разрешения MK.

Будет проведено прямое сравнение относительного количества микроорганизмов, выделенных из роговицы, конъюнктивы, век и носа участников, для выявления любых возможных эндогенных источников инфекции для МК. Совпадения микроорганизмов между участками отбора проб будут визуализированы с использованием диаграммы Венна и непараметрических тестов, используемых для оценки различий между участками отбора проб.