Untersuchung des Mikrobioms der Hornhaut bei mikrobieller Keratitis (STOICA)

Die mikrobielle Keratitis (MK) ist ein ophthalmologischer Notfall, der zu visusbedrohenden Komplikationen wie Hornhautvernarbung, Perforation, Endophthalmitis und schließlich Erblindung führen kann. Der Patient benötigt eine aggressive topische antimikrobielle Therapie und eine engmaschige Überwachung des Ansprechens auf die Behandlung, oft einschließlich Krankenhausaufenthalt, gefolgt von häufigen ambulanten Besuchen.

Die Verbesserung der Ergebnisse hängt von der schnellen Identifizierung des verursachenden Mikroorganismus ab. Derzeit wird der wahrscheinlich ursächliche Mikroorganismus nur in etwa 30 bis 40 % der Fälle unter Verwendung herkömmlicher Schabemethoden und konventioneller Standarddiagnostikkulturen (CDC) isoliert, wobei es in der Regel bis zu 4 Tage dauert, bis die Ergebnisse dem Arzt vorliegen. Empfindlichere Methoden wie Mikroorganismus-gerichtete Polymerase-Kettenreaktion (MTPCR) und metagenomische Analyse erhöhen das Potenzial zum Nachweis von Mikroorganismen, können jedoch die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass kommensale Mikroorganismen aufgenommen werden, was es für den behandelnden Arzt schwierig macht, zu interpretieren, welcher der isolierten Organismen wahrscheinlich ist ursächlich für MK sein.

Eines der Hindernisse bei der Identifizierung der Organismen war die Schwierigkeit, Proben von der Hornhaut zu sammeln. Im Jahr 2015 entwickelte eine Gruppe unter der Leitung von Professor Kaye an der University of Liverpool eine nicht-invasive Hornhaut-Probenahmemethode unter Verwendung einer Hornhautabdruckmembran (CIM) aus Polytetrafluorethylen. Es zeigte sich, dass dies eine signifikant höhere Gesamtisolationsrate im Vergleich zu herkömmlichen Schabemethoden aufweist. Da es minimalinvasiv ist, bietet die CIM-Probenahmemethode eine einzigartige Gelegenheit, sowohl die betroffene Hornhaut als auch die nicht betroffene Hornhaut von Patienten mit MK sowie die Augen von Patienten zu entnehmen, die nicht von MK betroffen sind. Dies wird ein viel besseres Verständnis der klinischen Bedeutung isolierter Organismen bei MK ermöglichen.

Metagenomische Sequenzierungstechniken der nächsten Generation (NGS) ermöglichen die genomische Analyse aller Mikroben in einer Probe und liefern eine Fülle von Informationen über das Vorhandensein und die Wechselwirkung von Mikroorganismen sowie das Vorhandensein oder Fehlen von Genen für antimikrobielle Resistenz (AMR). Frühere Studien, die versuchten, das Mikrobiom der Augenoberfläche im gesunden Zustand mithilfe von Metagenomik zu charakterisieren, haben ein vielfältiges ansässiges homöostatisches Mikrobiom gezeigt, waren jedoch auf Abstriche beschränkt, die vom Augenlid, der Bindehaut und den Tränen und nicht von der Hornhaut entnommen wurden. Variationen im Mikrobiom wurden mit Erkrankungen wie dem Syndrom des trockenen Auges, dem Tragen von Kontaktlinsen und infektiösen Pathologien in Verbindung gebracht, einschließlich eines pathologischen Mikrobioms, das von Pseudomonas spp. dominiert wird. bei einer kleinen Anzahl von Patienten mit bakterieller Keratitis. Obwohl die Hornhaut die von MK betroffene Oberfläche ist, gibt es keine Daten zum gesunden Hornhautmikrobiom, da herkömmliche Probenahmemethoden invasiv waren.

Obwohl NGS innerhalb weniger Stunden personalisierte Ergebnisse generiert, ist seine Empfindlichkeit, alle vorhandenen Organismen zu erkennen, ohne deren klinische Bedeutung zu verstehen, ein Hindernis für seine Einführung in die klinische Praxis. In diesem Projekt werden die CIM-Probenahmemethode und die NGS-Verarbeitung verwendet, um das Verständnis der verursachenden Organismen in MK zu verbessern. Darüber hinaus wird durch Probenahme sowohl der betroffenen als auch der nicht betroffenen Augen von MK-Patienten und denen ohne MK eine diagnostische Regel entwickelt, um kommensale Organismen zu identifizieren und auszuschließen. Der Einschluss verschiedener Kontrollgruppen wird auch Aufschluss über den Einfluss von Kontaktlinsen und Augentropfen auf das Mikrobiom geben, die sowohl bei der Entstehung als auch bei der Behandlung von MK eine Rolle spielen. Dies wird die aktuelle Interpretation der Hornhautprobenergebnisse erheblich erleichtern und die potenzielle zukünftige Verwendung von NGS in der routinemäßigen ophthalmologischen klinischen Praxis erleichtern.

Ziele und Aufgaben

Das übergeordnete Ziel des Projekts ist es, die pathogenen Mikroorganismen bei Patienten mit MK durch ein besseres Verständnis des Hornhautmikrobioms bei Gesundheit und Krankheit besser zu definieren.

Dies wird durch die folgenden Ziele erreicht.

1. Analysieren Sie mit NGS das Hornhautmikrobiom des betroffenen und nicht betroffenen Auges von Patienten mit und ohne MK und vergleichen Sie es mit gleichzeitigen Ergebnissen von CDC und MTPCR.
2. Bestimmen Sie das mikrobiologische Spektrum der Hornhaut, der Augenoberfläche und angrenzender Strukturen bei Patienten mit MK, gesunden Kontrollpersonen, Kontaktlinsenträgern und Augentropfenbenutzern.

Studiendesign:

Design: Prospektive diagnostische Beobachtungsstudie und Methodenvergleich.

Studiendauer: Drei Jahre.

Anzahl und Art der Fächer:

151 Patienten mit MK werden rekrutiert. Dies basiert auf der folgenden Berechnung des Stichprobenumfangs: Die aktuelle diagnostische Standardreferenzmethode (CDM) hat eine diagnostische Genauigkeit von 40 %. Für die klinische Implementierung von NGS muss die diagnostische Genauigkeit auf mindestens 80 % steigen. NGS kann lediglich den Anteil der nachgewiesenen Mikroorganismen erhöhen. Um eine Diagnoserate von 80 % mit einem 95 %-Konfidenzintervall (mit einer Breite von 15 %) zu schätzen, werden 137 Teilnehmer benötigt. Diese Berechnung geht davon aus, dass die kleinste Diagnosegruppe eine Prävalenz von 20 % hat. Um eine 10-prozentige Rate eines möglichen Verlusts der Nachbeobachtung auszugleichen, werden wir 151 Patienten rekrutieren.

Wir werden auch 90 Teilnehmer für vier Kontrollgruppen rekrutieren:

1. 20 Patienten ohne MK in der Vorgeschichte, die keine Augentropfen verwenden
2. 20 Patienten ohne MK in der Vorgeschichte, die Kontaktlinsenträger sind
3. 20 Patienten, die keine MK in der Vorgeschichte hatten, aber wegen eines Glaukoms mit Augentropfen behandelt werden. Diese Gruppe wurde aufgenommen, um Veränderungen im Mikrobiom der Hornhaut zu untersuchen, die durch die Tropfenbehandlung sekundär sein könnten.
4. 30 Patienten mit Keratokonus, die sich einem Cross-Linking unterziehen, werden rekrutiert. Diesen Teilnehmern wird im Rahmen des routinemäßigen Cross-Linking-Verfahrens das Hornhautepithel entfernt. Dieses entfernte Epithel von einer ansonsten gesunden Hornhautoberfläche wird einen direkten Vergleich zwischen dem aus dem CIM charakterisierten Hornhautmikrobiom und dem direkt aus dem Epithel charakterisierten ermöglichen.

Klinische Datenerhebung

Bei der Vorstellung werden demografische Daten des Patienten, Risikofaktoren (Erkrankung der Augenoberfläche, Kontaktlinsentragen, frühere MK) und in der Vergangenheit erhaltene oder bei der Vorstellung angewendete Behandlungen zusammen mit Ulkusmerkmalen (Haupt- und Nebenachse des Hornhautgeschwürs) aus dem Interview eingeholt gemessen mit einer kontinuierlichen Skala). Es wird ein standardisiertes Datenerhebungsformular verwendet.

Bestkorrigierte Sehschärfe (BCVA), Größe, Lage und Tiefe des Geschwürs werden mit einem Spaltlampen-Biomikroskop aufgezeichnet. Ulkusgröße (kleine und große Achse) und Lage (Mindestabstand vom Limbus) werden gemessen. Die Geschwürtiefe wird auf einer nominalen Skala von 1-4 gemessen, basierend auf dem Prozentsatz der verbleibenden Hornhautdicke unter dem Geschwür.

Probenentnahme

Für jeden Teilnehmer werden die folgenden Proben gesammelt:

• Drei CIMs von den betroffenen und nicht betroffenen Augen von Teilnehmern mit MK oder von einem Auge von Kontrollteilnehmern.
• Abstriche von der Bindehaut der betroffenen und nicht betroffenen Augen, oberen Augenlider und Nase des Teilnehmers.

Drei CIMs (PTFE-Millipore-Kultureinsatz, Porengröße 0,40 Mikrometer) werden 5 Sekunden lang auf die Hornhautoberfläche und ein CIM 5 Sekunden lang mit sterilen Handschuhen auf die untere Fornix conjunctiva der Teilnehmer aufgetragen. Vor der Anwendung der CIMs wird ein topisches Anästhetikum (ein Tropfen 0,5 % Proxymethacain) in das untere Bindehautgewölbe eingeträufelt. Die erste von der Hornhaut der Teilnehmer erhaltene CIM-Probe wird in eine Flasche mit 0,5 ml BHI-Brühe für die Kultur gegeben und transportiert. Die aus der Hornhaut und der unteren Bindehaut der Teilnehmer gewonnenen CIMs werden in einem sterilen Röhrchen trocken gehalten. Zusätzlich zur beschriebenen Entnahme von Proben wird das Hornhautepithel, das Patienten entnommen wurde, die sich einer Hornhautvernetzung unterziehen, in einen sterilen Eppendorf gegeben und bei -80 °C gelagert. Abstriche werden der Reihe nach von der Bindehaut, den oberen Augenlidern und den vorderen Nasenlöchern des Teilnehmers genommen um das umgebende Mikrobiom und endogene Quellen zu charakterisieren.

Follow-up von MK-Teilnehmern

Teilnehmer mit klinisch vermutetem MK werden 3 Tage, 7 Tage und 1 Monat nach der Präsentation gemäß dem normalen Verfahren zur Nachsorge von MK nachuntersucht. Bei jedem Nachsorgetermin werden BCVA, Größe und Tiefe des Geschwürs aufgezeichnet. Alle Proben werden bei jedem Nachsorgetermin nur vom betroffenen Auge des Teilnehmers wiederholt. Dazu gehören drei Hornhaut-CIMS, Bindehaut-, Oberlid- und Nasenabstriche.

Aufarbeitung von Proben und Identifizierung von Mikroorganismen:

1. CDC (etablierter diagnostischer Standard): Blut-, Schokoladen- und Sabouraud-Dextrose-Agarplatten und eine 24-Stunden-Subkultur der BHI-Bouillon, die mit den Bakterientupfern und Membranen inokuliert wurde, werden nach 24 und 48 Stunden Inkubation auf Anzeichen von Bakterienwachstum untersucht.
2. MTPCR:DNA wird aus dem CIM und dem virologischen Bindehautabstrich extrahiert und quantifiziert. Ein Multiplex Microorganism Targeted PCR (MTPCR)-Mastermix, einschließlich Primern für HSV-1, HSV2, Akanthamöben, 16S- und 18S-ribosomale DNA, wird hergestellt und mit einem Echtzeit-PCR-Instrument PCR durchgeführt
3. NGS: Metagenomische Tests werden mit Hochdurchsatzplattformen wie dem Illumina HiSeq 4000 durchgeführt. Die Sequenzierungstiefe wird empirisch bestimmt. Genom-Alignments, Filterung und Pathogen-Calling werden unter Verwendung etablierter Pipelines durchgeführt. Für die taxonomische Klassifikation wird ein Analyseansatz basierend auf der Leseklassifikation angewendet. Es wird eine subtraktive Analysemethode angewendet, die auf der Entfernung von Wirts-DNA und gesundem Metagenom des Kontrollauges basiert.

Statistische Analyse:

Es wird ein Vergleich der Isolationsraten und identifizierten Bakterien aus der CDC-, MTPCR- und NGS-Verarbeitung von MK-Hornhautproben durchgeführt. Dies wird mit einem Venn-Diagramm visualisiert.

Für NGS-Daten werden wir mit dem Center of Genomic Research (CGR) zusammenarbeiten, um Taxonomie-Labels zuzuweisen und die relative Häufigkeit in jeder Probe zu berechnen. Für den Nachweis von AMR wird Software verwendet, um Reads direkt denen in einer umfassenden AMR-Datenbank zuzuordnen und die vorhandenen AMR-Gene zu melden.

Mikroorganismen, die in den Augen mit MK identifiziert wurden, werden dann mit dem anderen Kontrollauge und anderen Kontrollgruppen verglichen, und die subtraktive Bioinformatik-Methodik wird angewendet, um die wahrscheinlichsten pathogenen Organismen im Vergleich zu denen im gesunden Hornhautmikrobiom zu identifizieren.

Vergleiche der relativen Häufigkeit von Mikroorganismen, die aus MK-Hornhautproben während der Folgebesuche der Teilnehmer gewonnen wurden, werden verwendet, um Längsveränderungen im Hornhautmikrobiom während der Behandlung und Auflösung von MK zu bewerten.

Ein direkter Vergleich zwischen der relativen Häufigkeit von Mikroorganismen, die aus Hornhaut, Bindehaut, Augenlidern und Nase der Teilnehmer isoliert wurden, wird durchgeführt, um mögliche endogene Infektionsquellen für MK zu identifizieren. Überlappungen von Mikroorganismen zwischen den Probenstellen werden mithilfe eines Venn-Diagramms visualisiert, und nichtparametrische Tests werden verwendet, um Unterschiede zwischen den Probenstellen zu ermitteln.