Investigación del Microbioma de la Córnea en la Queratitis Microbiana (STOICA)

La queratitis microbiana (MK) es una emergencia oftalmológica que puede provocar complicaciones que amenazan la vista, como cicatrización de la córnea, perforación, endoftalmitis y, en última instancia, ceguera. El paciente requiere una terapia antimicrobiana tópica agresiva y un control estricto de la respuesta al tratamiento, que a menudo incluye hospitalización seguida de visitas ambulatorias frecuentes.

La mejora de los resultados depende de la rápida identificación del microorganismo causante. Actualmente, el probable microorganismo causante solo se aísla en alrededor del 30 al 40 % de los casos utilizando métodos tradicionales de raspado y cultivo de diagnóstico convencional estándar (CDC), y los resultados suelen tardar hasta 4 días en estar disponibles para el médico. Los métodos más sensibles, como la reacción en cadena de la polimerasa dirigida a microorganismos (MTPCR) y el análisis metagenómico, aumentan el potencial para detectar microorganismos, pero pueden aumentar la probabilidad de detectar microorganismos comensales, lo que dificulta que el médico tratante interprete cuál de los organismos aislados es probable que ser causal en MK.

Una de las barreras para identificar los organismos ha sido la dificultad de recolectar muestras de la córnea. En 2015, un grupo dirigido por el profesor Kaye de la Universidad de Liverpool desarrolló una metodología de muestreo corneal no invasivo utilizando una membrana de impresión corneal (CIM) hecha de politetrafluoroetileno. Se demostró que esto tiene una tasa de aislamiento general significativamente más alta en comparación con los métodos de raspado convencionales. Como es mínimamente invasivo, el método de muestreo CIM ofrece una oportunidad única para tomar muestras tanto de la córnea afectada como de la córnea no afectada de pacientes que presentan MK, así como de los ojos de pacientes no afectados por MK. Esto permitirá una mejor comprensión de la importancia clínica de los organismos aislados en MK.

Las técnicas de secuenciación metagenómica de próxima generación (NGS) permiten el análisis genómico de todos los microbios en una muestra, brindando una gran cantidad de información sobre la presencia e interacción de microorganismos, así como la presencia o ausencia de genes de resistencia antimicrobiana (AMR). Estudios previos que intentaron caracterizar el microbioma de la superficie ocular en la salud usando metagenómica han demostrado un microbioma homeostático residente diverso, sin embargo, se han limitado a hisopos tomados del párpado, la conjuntiva y las lágrimas en lugar de la córnea. Las variaciones en el microbioma se han asociado con afecciones como el síndrome del ojo seco, el uso de lentes de contacto y patologías infecciosas, incluido un microbioma patológico dominado por pseudomonas spp. en un pequeño número de pacientes con queratitis bacteriana. A pesar de que la córnea es la superficie afectada por MK, no hay datos sobre el microbioma corneal sano porque los métodos de muestreo tradicionales han sido invasivos.

A pesar de que NGS genera resultados personalizados en cuestión de horas, su sensibilidad para detectar todos los organismos presentes sin comprender su importancia clínica es una barrera para su introducción en la práctica clínica. En este proyecto, el método de muestreo CIM y el procesamiento NGS se utilizarán para mejorar la comprensión de los organismos causales en MK. Además, mediante el muestreo de los ojos afectados y no afectados de pacientes con MK y de aquellos sin MK, se desarrollará una regla de diagnóstico para identificar y descartar organismos comensales. La inclusión de diferentes grupos de control también proporcionará información sobre la influencia de las lentes de contacto y los colirios en el microbioma, que tienen un papel tanto en el desarrollo como en el tratamiento de la MK. Esto facilitará en gran medida la interpretación actual de los resultados de las muestras de córnea y facilitará el uso futuro potencial de NGS en la práctica clínica oftalmológica de rutina.

Fines y objetivos

El objetivo general del proyecto es definir mejor los microorganismos patógenos en pacientes con MK a través de una mejor comprensión del microbioma corneal en la salud y la enfermedad.

Esto se logrará a través de los siguientes objetivos.

1. Usando NGS, analice el microbioma corneal del ojo afectado y no afectado de pacientes con y sin MK y compárelo con los resultados simultáneos de CDC y MTPCR.
2. Determinar el espectro microbiológico de la córnea, superficie ocular y estructuras contiguas, en pacientes con MK, controles sanos, usuarios de lentes de contacto y colirios.

Diseño del estudio:

Diseño: Estudio diagnóstico observacional prospectivo y comparación de métodos.

Duración del estudio: tres años.

Número y tipo de asignaturas:

Se reclutarán 151 pacientes con MK. Esto se basa en el siguiente cálculo del tamaño de la muestra: El método estándar de referencia de diagnóstico (CDM) actual tiene una precisión diagnóstica del 40 %. Para la implementación clínica de NGS, se requerirá que la precisión diagnóstica aumente al menos al 80%. NGS solo puede aumentar la proporción de microorganismos detectados. Para estimar una tasa de diagnóstico del 80% con un intervalo de confianza del 95% (de ancho 15%) se requieren 137 participantes. Este cálculo asume que el grupo de diagnóstico más pequeño tiene una prevalencia del 20%. Para ajustar una tasa del 10 % de posible pérdida de seguimiento, reclutaremos 151 pacientes.

También reclutaremos 90 participantes en cuatro grupos de control:

1. 20 pacientes sin antecedentes de MK que no usan colirio
2. 20 pacientes sin antecedentes de MK que son usuarios de lentes de contacto
3. 20 pacientes que no tienen antecedentes de MK pero están en tratamiento con gotas para el glaucoma. Este grupo se ha incluido para evaluar los cambios en el microbioma corneal que podrían ser secundarios al tratamiento con gotas.
4. Se reclutarán 30 pacientes con queratocono que se someten a cross-linking. A estos participantes, como parte del procedimiento de entrecruzamiento de rutina, se les extirpará el epitelio corneal. Este epitelio extraído de una superficie corneal sana permitirá una comparación directa entre el microbioma corneal caracterizado del CIM y el caracterizado directamente del epitelio.

Recopilación de datos clínicos

En la presentación, se obtendrán de la entrevista los datos demográficos del paciente, los factores de riesgo (enfermedad de la superficie ocular, uso de lentes de contacto, MK anterior) y el tratamiento recibido en el pasado o utilizado en la presentación, junto con las características de la úlcera (ejes mayor y menor de la úlcera corneal). medida usando una escala continua). Se utilizará un formulario estandarizado de recopilación de datos.

La mejor agudeza visual corregida (BCVA), el tamaño, la ubicación y la profundidad de la úlcera se registrarán utilizando un biomicroscopio con lámpara de hendidura. Se medirá el tamaño de la úlcera (ejes mayor y menor) y la ubicación (distancia mínima desde el limbo). La profundidad de la úlcera se medirá en una escala nominal de 1 a 4 basada en el porcentaje de espesor corneal restante debajo de la úlcera.

Coleccion de especimenes

Para cada participante, se recogerán las siguientes muestras:

• Tres CIM de los ojos afectados y no afectados de los participantes con MK, o de un ojo de los participantes de control.
• Hisopos de la conjuntiva de los ojos, los párpados superiores y la nariz afectados y no afectados del participante.

Se aplicarán tres CIM (inserto de cultivo de PTFE Millipore, tamaño de poro de 0,40 micrómetros) en la superficie de la córnea durante 5 segundos y un CIM en el fórnix conjuntivo inferior de los participantes durante 5 segundos usando guantes estériles. Se instilará un anestésico tópico (una gota de proxymethacaine al 0,5 %) en el fórnix conjuntival inferior antes de la aplicación de las CIM. La primera muestra de CIM obtenida de la córnea de los participantes se colocará y transportará en una botella que contiene 0,5 ml de caldo BHI para cultivo. Los CIM obtenidos de la córnea y la conjuntiva inferior de los participantes se mantendrán secos en un tubo estéril. Además de la recolección de muestras descrita, el epitelio corneal extraído de pacientes sometidos a entrecruzamiento corneal se colocará en un eppendorf estéril y se almacenará a -80 C. Se tomarán muestras de la conjuntiva, los párpados superiores y las narinas anteriores del participante para para caracterizar el microbioma circundante y las fuentes endógenas.

Seguimiento de participantes de MK

Los participantes que se presenten con sospecha clínica de MK recibirán un seguimiento a los 3 días, 7 días y 1 mes después de la presentación, según el procedimiento normal para el seguimiento de MK. En cada cita de seguimiento se registrará la BCVA, el tamaño y la profundidad de la úlcera. Todas las muestras se repetirán en cada cita de seguimiento solo del ojo afectado de los participantes. Estos incluirán tres hisopos CIMS corneales, conjuntivales, del párpado superior y nasales.

Procesado de muestras e identificación de microorganismos:

1. CDC (estándar de diagnóstico establecido): se examinarán las placas de agar de dextrosa de sangre, chocolate y Sabouraud y un subcultivo de 24 horas del caldo BHI inoculado con hisopos bacterianos y membranas para detectar evidencia de crecimiento bacteriano después de 24 y 48 horas de incubación.
2. MTPCR:ADN se extraerá y cuantificará del hisopo conjuntival CIM y virología. Se preparará una mezcla maestra de PCR dirigida a microorganismos múltiples (MTPCR), que incluye cebadores para HSV-1, HSV2, acanthamoeba, ADN ribosómico 16S y 18S y se realizará la PCR utilizando un instrumento de PCR en tiempo real.
3. NGS: las pruebas metagenómicas se realizarán utilizando plataformas de alto rendimiento, como Illumina HiSeq 4000. La profundidad de secuenciación se determinará empíricamente. Las alineaciones del genoma, el filtrado y la llamada de patógenos se realizarán utilizando canalizaciones establecidas. Se aplicará un enfoque de análisis basado en la clasificación de lectura para la clasificación taxonómica. Se aplicará un método de análisis sustractivo basado en la eliminación del ADN del huésped y el metagenoma del ojo de control sano.

Análisis estadístico:

Se realizará una comparación de las tasas de aislamiento y las bacterias identificadas obtenidas del procesamiento de CDC, MTPCR y NGS de muestras de córnea MK. Esto se visualizará mediante un diagrama de Venn.

Para los datos de NGS, trabajaremos con el Centro de Investigaciones Genómicas (CGR) para asignar etiquetas de taxonomía y calcular abundancias relativas en cada muestra. Para la detección de AMR, se utilizará software para mapear directamente las lecturas en una base de datos de AMR integral e informar los genes de AMR presentes.

Los microorganismos identificados en los ojos con MK luego se compararán con el otro ojo de control y otros grupos de control y se aplicará la metodología bioinformática sustractiva para identificar los organismos patógenos más probables en comparación con los observados en el microbioma corneal sano.

Se utilizarán comparaciones de la abundancia relativa de microorganismos obtenidos de muestras corneales de MK durante las visitas de seguimiento de los participantes para evaluar los cambios longitudinales en el microbioma corneal durante el tratamiento y la resolución de MK.

Se realizará una comparación directa entre la abundancia relativa de microorganismos aislados de la córnea, la conjuntiva, los párpados y la nariz de los participantes para identificar cualquier posible fuente endógena de infección por MK. Las superposiciones de microorganismos entre los sitios de muestra se visualizarán mediante un diagrama de Venn y se usarán pruebas no paramétricas para evaluar las diferencias entre los sitios de muestra.