微生物性角膜炎角膜微生物组的调查 (STOICA)

微生物性角膜炎 (MK) 是一种眼科急症，可导致威胁视力的并发症，例如角膜瘢痕形成、穿孔、眼内炎并最终导致失明。 患者需要积极的局部抗菌治疗和密切的治疗反应监测，通常包括住院治疗和频繁的门诊就诊。

改善结果取决于快速识别致病微生物。 目前，可能的致病微生物仅在大约 30% 到 40% 的病例中分离出来，使用传统的刮取方法和标准的常规诊断培养 (CDC)，临床医生通常需要长达 4 天的时间才能获得结果。 更灵敏的方法，如微生物靶向聚合酶链反应 (MTPCR) 和宏基因组分析，增加了检测微生物的可能性，但也可能增加检出共生微生物的可能性，这使得治疗临床医生难以解释哪些分离的生物体可能会感染在 MK 中起因作用。

识别生物体的障碍之一是难以从角膜收集样本。 2015 年，利物浦大学 Kaye 教授领导的一个小组使用聚四氟乙烯制成的角膜印模膜 (CIM) 开发了一种非侵入性角膜取样方法。 与传统的刮擦方法相比，这被证明具有更高的整体隔离率。 由于它是微创的，CIM 取样方法提供了一个独特的机会，可以对患有 MK 的患者的受影响角膜和未受影响的角膜以及未受 MK 影响的患者的眼睛进行取样。 这将使人们更好地了解 MK 中分离生物体的临床意义。

宏基因组下一代测序 (NGS) 技术可以对样本中的所有微生物进行基因组分析，提供有关微生物存在和相互作用以及抗菌素耐药性 (AMR) 基因存在与否的大量信息。 以前的研究试图使用宏基因组学来表征健康眼表微生物组，已经证明了多样化的常驻稳态微生物组，然而，仅限于从眼睑、结膜和眼泪而不是角膜上采集的拭子。 微生物组的变化与干眼症、隐形眼镜佩戴和感染性病理等病症有关，包括以假单胞菌属为主的病理微生物组。少数细菌性角膜炎患者。 尽管角膜是受 MK 影响的表面，但没有关于健康角膜微生物组的数据，因为传统的取样方法是侵入性的。

尽管 NGS 可在数小时内生成个性化结果，但其在不了解其临床意义的情况下检测所有存在的生物体的敏感性是将其引入临床实践的障碍。 在该项目中，将使用 CIM 采样方法和 NGS 处理来提高对 MK 中致病微生物的了解。 此外，通过对 MK 患者和未患 MK 患者受影响和未受影响的眼睛进行采样，将制定诊断规则以识别和排除共生生物。 纳入不同的对照组也将提供有关隐形眼镜和滴眼液对微生物组影响的信息，这对 MK 的发展和治疗都有作用。 这将极大地促进目前对角膜样本结果的解释，并促进未来在常规眼科临床实践中使用 NGS。

目的和目标

该项目的总体目标是通过更好地了解健康和疾病中的角膜微生物组，更好地确定 MK 患者的病原微生物。

这将通过以下目标实现。

1. 使用 NGS，分析患有和未患有 MK 的患者受影响和未受影响的眼睛的角膜微生物组，并与 CDC 和 MTPCR 的同步结果进行比较。
2. 确定 MK 患者、健康对照者、隐形眼镜佩戴者和滴眼液使用者的角膜、眼表和邻近结构的微生物谱。

学习规划：

设计：前瞻性观察诊断研究和方法比较。

学习期限：三年。

科目数量和类型：

将招募 151 名 MK 患者。 这是基于以下样本量计算得出的： 当前标准诊断参考方法 (CDM) 的诊断准确率为 40%。 对于NGS的临床实施，诊断准确率将需要提高到至少80%。 NGS只能增加检测到的微生物的比例。 要以 95% 的置信区间（宽度为 15%）估计 80% 的诊断率，需要 137 名参与者。 此计算假设最小诊断组的患病率为 20%。 为了调整 10% 的可能失访率，我们将招募 151 名患者。

我们还将招募 90 名参与者到四个对照组：

1. 20名无MK病史且不使用眼药水的患者
2. 20 名无 MK 病史的隐形眼镜佩戴者
3. 20名无MK病史但因青光眼滴眼液治疗的患者。 该小组已被包括在内，以评估可能继发于滴眼液治疗的角膜微生物群的变化。
4. 将招募 30 名正在进行交联的圆锥角膜患者。 作为常规交联程序的一部分，这些参与者的角膜上皮将被移除。 这种从其他方面健康的角膜表面去除的上皮细胞将允许直接比较从 CIM 表征的角膜微生物组和直接从上皮表征的角膜微生物组。

临床数据收集

就诊时，患者的人口统计资料、风险因素（眼表疾病、隐形眼镜佩戴、既往 MK）、过去接受的治疗或就诊时使用的治疗，以及溃疡特征（角膜溃疡的长轴和短轴）使用连续刻度测量）。 将使用标准化的数据收集表。

将使用裂隙灯生物显微镜记录溃疡的最佳矫正视力 (BCVA)、大小、位置和深度。 将测量溃疡大小（短轴和长轴）和位置（距角膜缘的最小距离）。 溃疡深度将根据溃疡下方剩余角膜厚度的百分比以 1-4 的标称等级测量。

标本采集

对于每个参与者，将收集以下样本：

• 来自 MK 参与者受影响和未受影响的眼睛的三个 CIM，或来自控制参与者的一只眼睛。
• 参与者受影响和未受影响的眼睛、上眼睑和鼻子的结膜拭子。

将使用无菌手套将三个 CIM（PTFE Millipore 培养插入物，孔径 0.40 微米）应用于角膜表面 5 秒，并将一个 CIM 应用于参与者下穹窿结膜 5 秒。 在应用 CIM 之前，将局部麻醉剂（一滴 0.5% 代理美卡因）滴入下结膜穹窿。 从参与者角膜获得的第一个 CIM 样本将被放置和运输到一个装有 0.5mL BHI 肉汤的瓶子中进行培养。 从参与者角膜和下结膜获得的 CIM 将在无菌管中保持干燥。 除了所描述的样本收集之外，将从进行角膜交联的患者身上取出的角膜上皮细胞将被放置在无菌 eppendorf 中并储存在 -80 C 下。将从参与者的结膜、上眼睑和前鼻孔中依次取出拭子表征周围的微生物组和内源性来源。

MK参与者跟进

按照正常的 MK 随访程序，将在出现后 3 天、7 天和 1 个月对出现临床疑似 MK 的参与者进行随访。 在每次随访预约 BCVA 时，将记录溃疡的大小和深度。 所有样本将在每次跟进预约时仅从受影响的眼睛的参与者那里重复。 这些将包括三个角膜 CIMS、结膜、上眼睑和鼻拭子。

样品处理和微生物鉴定：

1. CDC（既定诊断标准）：将检查血液、巧克力和沙氏葡萄糖琼脂平板以及接种细菌拭子和膜的 BHI 肉汤的 24 小时继代培养物，以检查 24 小时和 48 小时孵育后细菌生长的证据。
2. MTPCR：将从 CIM 和病毒学结膜拭子中提取和量化 DNA。 将制备多重微生物靶向 PCR (MTPCR) 主混合物，包括 HSV-1、HSV2、棘阿米巴、16S 和 18S 核糖体 DNA 的引物，并使用实时 PCR 仪器进行 PCR
3. NGS：宏基因组测试将使用高通量平台进行，例如 Illumina HiSeq 4000。 测序深度将根据经验确定。 基因组比对、过滤和病原体检出将使用已建立的管道进行。 基于读取分类的分析方法将应用于分类学分类。 将应用基于去除宿主 DNA 和健康对照眼宏基因组的减法分析方法。

统计分析：

将从 MK 角膜样本的 CDC、MTPCR 和 NGS 处理中获得的分离率和鉴定细菌进行比较。 这将使用维恩图可视化。

对于 NGS 数据，我们将与基因组研究中心 (CGR) 合作，分配分类标签并计算每个样本的相对丰度。 为了检测 AMR，将使用软件将读数直接映射到综合 AMR 数据库中的读数，并报告存在的 AMR 基因。

然后将在患有 MK 的眼睛中鉴定出的微生物与对照眼和其他对照组进行比较，并应用减法生物信息学方法来鉴定与健康角膜微生物组中观察到的微生物相比最可能的致病微生物。

从 MK 角膜样本中获得的微生物相对丰度与参与者随访的比较将用于评估 MK 治疗和消退期间角膜微生物组的纵向变化。

将从参与者角膜、结膜、眼睑和鼻子中分离出的微生物的相对丰度进行直接比较，以确定 MK 的任何可能的内源性感染源。 样本点之间的微生物重叠将使用维恩图和用于评估样本点之间差异的非参数测试来可视化。