Indagine sul microbioma della cornea nella cheratite microbica (STOICA)

La cheratite microbica (MK) è un'emergenza oftalmologica che può portare a complicanze minacciose per la vista come cicatrizzazione corneale, perforazione, endoftalmite e infine cecità. Il paziente richiede una terapia antimicrobica topica aggressiva e un attento monitoraggio della risposta al trattamento, che spesso include il ricovero in ospedale seguito da frequenti visite ambulatoriali.

Il miglioramento dei risultati dipende dalla rapida identificazione del microrganismo responsabile. Attualmente il probabile microrganismo causale è isolato solo in circa il 30-40% dei casi utilizzando metodi tradizionali di raschiamento e coltura diagnostica convenzionale standard (CDC), con risultati che in genere richiedono fino a 4 giorni per essere disponibili al medico. Metodi più sensibili come la reazione a catena della polimerasi mirata ai microrganismi (MTPCR) e l'analisi metagenomica aumentano il potenziale per rilevare i microrganismi, ma possono aumentare la probabilità di rilevare microrganismi commensali, rendendo difficile per il medico curante interpretare quale degli organismi isolati è probabile che essere causativo in MK.

Uno degli ostacoli all'identificazione degli organismi è stata la difficoltà nel raccogliere campioni dalla cornea. Nel 2015, un gruppo guidato dal professor Kaye dell'Università di Liverpool ha sviluppato una metodologia di campionamento corneale non invasiva utilizzando una membrana per impronte corneali (CIM) realizzata in politetrafluoroetilene. È stato dimostrato che questo ha un tasso di isolamento complessivo significativamente più elevato rispetto ai metodi di raschiatura convenzionali. Poiché è minimamente invasivo, il metodo di campionamento CIM offre un'opportunità unica per campionare sia la cornea interessata che la cornea non affetta di pazienti che presentano MK, nonché gli occhi di pazienti non affetti da MK. Ciò consentirà una comprensione molto migliore del significato clinico degli organismi isolati in MK.

Le tecniche di sequenziamento metagenomico di nuova generazione (NGS) consentono l'analisi genomica di tutti i microbi in un campione, fornendo una grande quantità di informazioni riguardanti la presenza e l'interazione dei microrganismi, nonché la presenza o l'assenza di geni di resistenza antimicrobica (AMR). Precedenti studi che tentavano di caratterizzare il microbioma della superficie oculare in salute utilizzando la metagenomica hanno dimostrato un diverso microbioma omeostatico residente, tuttavia, sono stati limitati ai tamponi prelevati dal coperchio, dalla congiuntiva e dalle lacrime piuttosto che dalla cornea. Le variazioni nel microbioma sono state associate a condizioni come la sindrome dell'occhio secco, l'uso di lenti a contatto e patologie infettive, incluso un microbioma patologico dominato da pseudomonas spp. in un piccolo numero di pazienti con cheratite batterica. Nonostante la cornea sia la superficie interessata da MK, non ci sono dati riguardanti il ​​microbioma corneale sano perché i metodi di campionamento tradizionali sono stati invasivi.

Nonostante NGS generi risultati personalizzati nel giro di poche ore, la sua sensibilità nel rilevare tutti i microrganismi presenti senza una comprensione del loro significato clinico è un ostacolo alla sua introduzione nella pratica clinica. In questo progetto, il metodo di campionamento CIM e l'elaborazione NGS saranno utilizzati per migliorare la comprensione degli organismi causali in MK. Inoltre, attraverso il campionamento sia degli occhi affetti che di quelli sani di pazienti affetti da MK e da quelli senza MK, verrà sviluppata una regola diagnostica per identificare e scartare i microrganismi commensali. L'inclusione di diversi gruppi di controllo fornirà anche informazioni sull'influenza delle lenti a contatto e dei colliri sul microbioma, che hanno un ruolo sia sullo sviluppo che sul trattamento della MK. Ciò faciliterà notevolmente l'attuale interpretazione dei risultati dei campioni corneali e faciliterà il potenziale uso futuro di NGS nella pratica clinica oftalmica di routine.

Finalità e obiettivi

L'obiettivo generale del progetto è quello di definire meglio i microrganismi patogeni nei pazienti con MK attraverso una migliore comprensione del microbioma corneale in condizioni di salute e malattia.

Ciò sarà raggiunto attraverso i seguenti obiettivi.

1. Utilizzando NGS, analizzare il microbioma corneale dell'occhio affetto e non affetto di pazienti con e senza MK e confrontarlo con i risultati simultanei di CDC e MTPCR.
2. Determinare lo spettro microbiologico della cornea, della superficie oculare e delle strutture contigue, in pazienti con MK, controlli sani, portatori di lenti a contatto e utilizzatori di colliri.

Disegno dello studio:

Disegno: studio diagnostico osservazionale prospettico e confronto tra metodi.

Durata dello studio: tre anni.

Numero e tipologia di soggetti:

Saranno reclutati 151 pazienti con MK. Questo si basa sul seguente calcolo della dimensione del campione: L'attuale metodo di riferimento diagnostico standard (CDM) ha un'accuratezza diagnostica del 40%. Per l'implementazione clinica di NGS, l'accuratezza diagnostica dovrà aumentare almeno all'80%. NGS può solo aumentare la percentuale di microrganismi rilevati. Per stimare un tasso diagnostico dell'80% con un intervallo di confidenza del 95% (di ampiezza 15%) sono richiesti 137 partecipanti. Questo calcolo presuppone che il gruppo diagnostico più piccolo abbia una prevalenza del 20%. Per adeguarsi a un tasso del 10% di possibile perdita di follow-up, recluteremo 151 pazienti.

Recluteremo anche 90 partecipanti in quattro gruppi di controllo:

1. 20 pazienti senza storia di MK che non usano farmaci per il collirio
2. 20 pazienti senza storia di MK portatori di lenti a contatto
3. 20 pazienti che non hanno una storia di MK ma sono in trattamento con collirio per il glaucoma. Questo gruppo è stato incluso per valutare i cambiamenti nel microbioma corneale che potrebbero essere secondari alla caduta del trattamento.
4. Saranno reclutati 30 pazienti con cheratocono sottoposti a cross-linking. A questi partecipanti, come parte della procedura di routine di reticolazione, verrà rimosso l'epitelio corneale. Questo epitelio rimosso da una superficie corneale altrimenti sana consentirà un confronto diretto tra il microbioma corneale caratterizzato dal CIM e quello caratterizzato direttamente dall'epitelio.

Raccolta dati clinici

Alla presentazione, i dati demografici del paziente, i fattori di rischio (malattia della superficie oculare, uso di lenti a contatto, precedente MK) e il trattamento ricevuto in passato o utilizzato alla presentazione saranno ottenuti dall'intervista, insieme alle caratteristiche dell'ulcera (assi maggiore e minore dell'ulcera corneale misurato utilizzando una scala continua). Verrà utilizzato un modulo di raccolta dati standardizzato.

La migliore acuità visiva corretta (BCVA), le dimensioni, la posizione e la profondità dell'ulcera saranno registrate utilizzando un biomicroscopio con lampada a fessura. Verranno misurate le dimensioni dell'ulcera (assi minore e maggiore) e la posizione (distanza minima dal limbus). La profondità dell'ulcera sarà misurata su una scala nominale da 1 a 4 basata sulla percentuale dello spessore corneale rimanente sotto l'ulcera.

Raccolta di campioni

Per ogni partecipante verranno raccolti i seguenti campioni:

• Tre CIM dagli occhi affetti e non affetti dei partecipanti con MK, o da un occhio dei partecipanti di controllo.
• Tamponi dalla congiuntiva degli occhi, delle palpebre superiori e del naso affetti e non affetti del partecipante.

Verranno applicati tre CIM (inserto di coltura PTFE Millipore, dimensione dei pori 0,40 micrometri) alla superficie della cornea per 5 secondi e un CIM alla congiuntiva fornice inferiore dei partecipanti per 5 secondi utilizzando guanti sterili. Un anestetico topico (una goccia di proxymetacaina allo 0,5%) verrà instillato nel fornice congiuntivale inferiore prima dell'applicazione dei CIM. Il primo campione CIM ottenuto dalla cornea dei partecipanti verrà posto e trasportato in una bottiglia contenente 0,5 ml di brodo BHI per coltura. I CIM ottenuti dalla cornea dei partecipanti e dalla congiuntiva inferiore saranno tenuti asciutti in un tubo sterile. Oltre alla raccolta di campioni descritta, l'epitelio corneale rimosso dai pazienti sottoposti a reticolazione corneale verrà posto in un eppendorf sterile e conservato a -80 C. I tamponi verranno prelevati dalla congiuntiva, dalle palpebre superiori e dalle narici anteriori del partecipante in ordine per caratterizzare il microbioma circostante e le fonti endogene.

Follow-up dei partecipanti MK

I partecipanti che si presentano con MK clinicamente sospetta saranno seguiti a 3 giorni, 7 giorni e 1 mese dopo la presentazione, come da normale procedura per il follow-up di MK. Ad ogni appuntamento di follow-up BCVA, verranno registrate le dimensioni e la profondità dell'ulcera. Tutti i campioni verranno ripetuti ad ogni appuntamento di follow-up solo dall'occhio interessato dai partecipanti. Questi includeranno tre CIMS corneali, congiuntivali, della palpebra superiore e tamponi nasali.

Trattamento dei campioni e identificazione dei microrganismi:

1. CDC (standard diagnostico stabilito): sangue, cioccolato e piastre di agar destrosio di Sabouraud e una sottocoltura di 24 ore del brodo BHI inoculato con i tamponi e le membrane batteriche saranno esaminati per evidenza di crescita batterica dopo 24 e 48 ore di incubazione.
2. MTPCR:DNA sarà estratto e quantificato dal tampone congiuntivale CIM e virologico. Verrà preparata una master mix per PCR mirata a microrganismi multiplex (MTPCR), inclusi i primer per HSV-1, HSV2, acanthamoeba, DNA ribosomiale 16S e 18S e la PCR verrà eseguita utilizzando uno strumento per PCR in tempo reale
3. NGS: i test metagenomici verranno eseguiti utilizzando piattaforme ad alto rendimento, come Illumina HiSeq 4000. La profondità di sequenziamento sarà determinata empiricamente. Gli allineamenti del genoma, il filtraggio e l'identificazione dei patogeni saranno eseguiti utilizzando pipeline consolidate. Per la classificazione tassonomica verrà applicato un approccio di analisi basato sulla classificazione delle letture. Verrà applicato un metodo di analisi sottrattiva basato sulla rimozione del DNA dell'ospite e del metagenoma dell'occhio di controllo sano.

Analisi statistica:

Verrà effettuato un confronto dei tassi di isolamento e dei batteri identificati ottenuti dal trattamento CDC, MTPCR e NGS di campioni corneali MK. Questo sarà visualizzato utilizzando un diagramma di Venn.

Per i dati NGS, lavoreremo con il Center of Genomic Research (CGR) per assegnare etichette di tassonomia e calcolare le abbondanze relative in ciascun campione. Per il rilevamento dell'AMR, il software verrà utilizzato per mappare direttamente le letture a quelle in un database AMR completo e riportare i geni AMR presenti.

I microrganismi identificati negli occhi con MK saranno quindi confrontati con l'occhio di controllo e altri gruppi di controllo e la metodologia bioinformatica sottrattiva applicata per identificare gli organismi patogeni più probabili rispetto a quelli osservati nel microbioma corneale sano.

Verranno utilizzati i confronti dell'abbondanza relativa di microrganismi ottenuti dai campioni corneali di MK durante le visite di follow-up dei partecipanti per valutare i cambiamenti longitudinali nel microbioma corneale durante il trattamento e la risoluzione di MK.

Verrà effettuato un confronto diretto tra l'abbondanza relativa di microrganismi isolati dalla cornea, dalla congiuntiva, dalle palpebre e dal naso dei partecipanti per identificare eventuali fonti endogene di infezione per MK. Le sovrapposizioni di microrganismi tra i siti campione saranno visualizzate utilizzando un diagramma di Venn e test non parametrici utilizzati per valutare le differenze tra i siti campione.