Badanie mikrobiomu rogówki w mikrobiologicznym zapaleniu rogówki (STOICA)

Mikrobiologiczne zapalenie rogówki (MK) to nagły przypadek okulistyczny, który może prowadzić do powikłań zagrażających wzrokowi, takich jak bliznowacenie rogówki, perforacja, zapalenie wnętrza gałki ocznej i ostatecznie ślepota. Pacjent wymaga agresywnej miejscowej terapii przeciwbakteryjnej i ścisłego monitorowania odpowiedzi na leczenie, często obejmującej hospitalizację, po której następują częste wizyty ambulatoryjne.

Poprawa wyników zależy od szybkiej identyfikacji mikroorganizmu sprawczego. Obecnie prawdopodobny mikroorganizm sprawczy jest izolowany tylko w około 30 do 40% przypadków przy użyciu tradycyjnych metod zeskrobywania i standardowej konwencjonalnej kultury diagnostycznej (CDC), a wyniki stają się dostępne dla klinicysty zwykle po 4 dniach. Bardziej czułe metody, takie jak reakcja łańcuchowa polimerazy ukierunkowana na mikroorganizmy (MTPCR) i analiza metagenomiczna, zwiększają potencjał wykrywania mikroorganizmów, ale mogą zwiększać prawdopodobieństwo wykrycia mikroorganizmów komensalnych, co utrudnia lekarzowi prowadzącemu interpretację, który z wyizolowanych organizmów prawdopodobnie być przyczyną w MK.

Jedną z barier w identyfikacji organizmów była trudność w pobraniu próbek z rogówki. W 2015 roku grupa kierowana przez profesora Kaye z Uniwersytetu w Liverpoolu opracowała nieinwazyjną metodologię pobierania próbek rogówki przy użyciu błony wyciskowej rogówki (CIM) wykonanej z politetrafluoroetylenu. Wykazano, że ma to znacznie wyższy ogólny wskaźnik izolacji w porównaniu z konwencjonalnymi metodami zdrapywania. Ponieważ jest to metoda minimalnie inwazyjna, metoda pobierania próbek CIM oferuje wyjątkową możliwość pobrania próbek zarówno z rogówki dotkniętej chorobą, jak i rogówki zdrowej pacjentów z MK, a także oczu pacjentów bez MK. Umożliwi to znacznie lepsze zrozumienie klinicznego znaczenia izolowanych organizmów w MK.

Techniki metagenomicznego sekwencjonowania nowej generacji (NGS) umożliwiają analizę genomową wszystkich drobnoustrojów w próbce, dostarczając wielu informacji dotyczących obecności i interakcji mikroorganizmów, a także obecności lub braku genów oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR). Wcześniejsze badania mające na celu scharakteryzowanie mikrobiomu powierzchni oka w stanie zdrowia za pomocą metagenomiki wykazały zróżnicowany rezydentny homeostatyczny mikrobiom, jednak były one ograniczone do wymazów pobranych z powieki, spojówki i łez, a nie z rogówki. Zmiany w mikrobiomie są związane z takimi stanami, jak zespół suchego oka, noszenie soczewek kontaktowych i patologie zakaźne, w tym patologiczny mikrobiom zdominowany przez Pseudomonas spp. u niewielkiej liczby pacjentów z bakteryjnym zapaleniem rogówki. Pomimo tego, że rogówka jest powierzchnią dotkniętą MK, nie ma danych dotyczących zdrowego mikrobiomu rogówki, ponieważ tradycyjne metody pobierania próbek były inwazyjne.

Pomimo tego, że NGS generuje spersonalizowane wyniki w ciągu kilku godzin, jego czułość na wykrywanie wszystkich obecnych organizmów bez zrozumienia ich znaczenia klinicznego stanowi barierę we wprowadzeniu go do praktyki klinicznej. W tym projekcie metoda pobierania próbek CIM i przetwarzanie NGS zostaną wykorzystane do lepszego zrozumienia organizmów sprawczych w MK. Ponadto, poprzez pobieranie próbek zarówno dotkniętych, jak i zdrowych oczu pacjentów z MK oraz osób bez MK, zostanie opracowana reguła diagnostyczna w celu identyfikacji i dyskontowania organizmów komensalnych. Włączenie różnych grup kontrolnych dostarczy również informacji na temat wpływu soczewek kontaktowych i kropli do oczu na mikrobiom, które odgrywają rolę zarówno w rozwoju, jak i leczeniu MK. To znacznie ułatwi obecną interpretację wyników próbek rogówki i ułatwi potencjalne przyszłe zastosowanie NGS w rutynowej okulistycznej praktyce klinicznej.

Cele i zadania

Ogólnym celem projektu jest lepsze zdefiniowanie mikroorganizmów chorobotwórczych u pacjentów z MK poprzez lepsze zrozumienie mikrobiomu rogówki w zdrowiu i chorobie.

Zostanie to osiągnięte poprzez następujące cele.

1. Za pomocą NGS przeanalizuj mikrobiom rogówki chorego i zdrowego oka pacjentów z MK i bez MK i porównaj z jednoczesnymi wynikami z CDC i MTPCR.
2. Określ spektrum mikrobiologiczne rogówki, powierzchni oka i struktur przylegających u pacjentów z MK, zdrowych osób kontrolnych, osób noszących soczewki kontaktowe i stosujących krople do oczu.

Projekt badania:

Projekt: Prospektywne obserwacyjne badanie diagnostyczne i porównanie metod.

Czas trwania nauki: Trzy lata.

Liczba i rodzaj przedmiotów:

Zrekrutowanych zostanie 151 pacjentów z MK. Jest to oparte na następującym obliczeniu wielkości próby: Obecna standardowa diagnostyczna metoda referencyjna (CDM) ma dokładność diagnostyczną 40%. Do klinicznego wdrożenia NGS wymagana będzie dokładność diagnostyczna do co najmniej 80%. NGS może jedynie zwiększyć odsetek wykrywanych mikroorganizmów. Aby oszacować wskaźnik diagnostyczny na poziomie 80% z 95% przedziałem ufności (o szerokości 15%) potrzeba 137 uczestników. Obliczenia te zakładają, że najmniejsza grupa diagnostyczna ma chorobowość na poziomie 20%. Aby dostosować się do 10% wskaźnika możliwej utraty obserwacji, zrekrutujemy 151 pacjentów.

Zrekrutujemy również 90 uczestników do czterech grup kontrolnych:

1. 20 pacjentów bez historii MK, którzy nie stosują leków w postaci kropli do oczu
2. 20 pacjentów bez historii MK, którzy noszą soczewki kontaktowe
3. 20 pacjentów, którzy nie mieli historii MK, ale są leczeni kroplami do oczu z powodu jaskry. Ta grupa została włączona w celu oceny zmian w mikrobiomie rogówki, które mogą być wtórne do leczenia kroplami.
4. Zrekrutowanych zostanie 30 pacjentów ze stożkiem rogówki poddawanych sieciowaniu. U tych uczestników w ramach rutynowej procedury sieciowania zostanie usunięty nabłonek rogówki. Ten usunięty nabłonek z poza tym zdrowej powierzchni rogówki pozwoli na bezpośrednie porównanie między mikrobiomem rogówki scharakteryzowanym na podstawie CIM i tym scharakteryzowanym bezpośrednio na nabłonku.

Gromadzenie danych klinicznych

Podczas prezentacji dane demograficzne pacjenta, czynniki ryzyka (choroba powierzchni oka, noszenie soczewek kontaktowych, przebyte MK) oraz leczenie otrzymane w przeszłości lub stosowane podczas prezentacji zostaną uzyskane z wywiadu, wraz z charakterystyką owrzodzenia (główne i mniejsze osie owrzodzenia rogówki mierzony za pomocą skali ciągłej). Wykorzystany zostanie znormalizowany formularz zbierania danych.

Najlepsza skorygowana ostrość wzroku (BCVA), rozmiar, lokalizacja i głębokość owrzodzenia zostaną zarejestrowane przy użyciu biomikroskopu z lampą szczelinową. Zostanie zmierzony rozmiar wrzodu (mniejsza i większa oś) oraz lokalizacja (minimalna odległość od rąbka). Głębokość owrzodzenia będzie mierzona w nominalnej skali 1-4 w oparciu o procent pozostałej grubości rogówki pod owrzodzeniem.

Kolekcja próbek

Od każdego uczestnika zostaną pobrane następujące próbki:

• Trzy CIM z dotkniętych i zdrowych oczu uczestników z MK lub z jednego oka uczestników kontrolnych.
• Wymazy ze spojówek chorych i zdrowych oczu uczestnika, górnych powiek i nosa.

Trzy CIM (wkładka hodowlana PTFE Millipore, wielkość porów 0,40 mikrometra) zostaną nałożone na powierzchnię rogówki na 5 sekund i jeden CIM na dolną spojówkę oka uczestników na 5 sekund przy użyciu sterylnych rękawiczek. Miejscowy środek znieczulający (jedna kropla 0,5% proxymetakainy) zostanie wkroplony do dolnego sklepienia spojówki przed zastosowaniem CIM. Pierwsza próbka CIM pobrana z rogówki uczestnika zostanie umieszczona i przetransportowana do butelki zawierającej 0,5 ml bulionu BHI do hodowli. CIM uzyskane z rogówki i spojówki dolnej uczestników będą przechowywane w suchej probówce. Oprócz opisanego pobierania próbek, nabłonek rogówki pobrany od pacjentów poddawanych sieciowaniu rogówki zostanie umieszczony w sterylnym eppendorfie i przechowywany w temperaturze -80 C. Wymazy zostaną pobrane ze spojówki, powiek górnych i nozdrzy przednich pacjenta w kolejności scharakteryzować otaczający mikrobiom i źródła endogenne.

Kontynuacja uczestnika MK

Uczestnicy z klinicznym podejrzeniem MK będą obserwowani po 3 dniach, 7 dniach i 1 miesiącu po prezentacji, zgodnie z normalną procedurą obserwacji MK. Podczas każdej wizyty kontrolnej rejestrowana będzie BCVA, rozmiar i głębokość owrzodzenia. Wszystkie próbki zostaną powtórzone podczas każdej wizyty kontrolnej tylko od chorego oka uczestnika. Obejmą one trzy CIMS rogówki, spojówki, wymazy z górnej powieki i nosa.

Obróbka próbek i identyfikacja mikroorganizmów:

1. CDC (ustanowiony standard diagnostyczny): Płytki z krwią, czekoladą i agarem Sabourauda z dekstrozą oraz 24-godzinna podhodowla bulionu BHI zaszczepiona wymazami i błonami bakteryjnymi zostaną zbadane pod kątem obecności bakterii po 24 i 48 godzinach inkubacji.
2. MTPCR:DNA zostanie wyekstrahowany i określony ilościowo z CIM i wirusologicznego wymazu spojówkowego. Przygotowana zostanie mieszanka master mix ukierunkowana na mikroorganizmy PCR (MTPCR), w tym startery dla HSV-1, HSV2, acanthamoeba, rybosomalnego DNA 16S i 18S, a następnie zostanie przeprowadzona reakcja PCR przy użyciu instrumentu do PCR w czasie rzeczywistym
3. NGS: Testy metagenomiczne zostaną przeprowadzone przy użyciu platform o dużej przepustowości, takich jak Illumina HiSeq 4000. Głębokość sekwencjonowania zostanie określona empirycznie. Dopasowania genomu, filtrowanie i wywoływanie patogenów zostaną przeprowadzone przy użyciu ustalonych potoków. Do klasyfikacji taksonomicznej zastosowane zostanie podejście analityczne oparte na klasyfikacji odczytu. Zastosowana zostanie metoda analizy subtraktywnej oparta na usunięciu DNA gospodarza i metagenomu zdrowego oka kontrolnego.

Analiza statystyczna:

Dokonane zostanie porównanie wskaźników izolacji i zidentyfikowanych bakterii uzyskanych z przetwarzania próbek rogówki MK przez CDC, MTPCR i NGS. Zostanie to zwizualizowane za pomocą Diagramu Venna.

W przypadku danych NGS będziemy współpracować z Centrum Badań Genomicznych (CGR) w celu przypisania etykiet taksonomii i obliczenia względnych liczebności w każdej próbce. W celu wykrycia AMR zostanie użyte oprogramowanie do bezpośredniego mapowania odczytów z obszerną bazą danych AMR i zgłaszania obecnych genów AMR.

Mikroorganizmy zidentyfikowane w oczach za pomocą MK zostaną następnie porównane z kontrolnym innym okiem i innymi grupami kontrolnymi oraz subtraktywną metodologią bioinformatyczną zastosowaną do identyfikacji najbardziej prawdopodobnych organizmów chorobotwórczych w porównaniu z tymi obserwowanymi w zdrowym mikrobiomie rogówki.

Porównania względnej obfitości mikroorganizmów uzyskanych z próbek rogówki MK podczas wizyt kontrolnych uczestników zostaną wykorzystane do oceny podłużnych zmian w mikrobiomie rogówki podczas leczenia i ustąpienia MK.

Przeprowadzone zostanie bezpośrednie porównanie między względną liczebnością mikroorganizmów wyizolowanych z rogówki, spojówki, powiek i nosa uczestników, aby zidentyfikować wszelkie możliwe endogenne źródła zakażenia MK. Nakładanie się mikroorganizmów między miejscami pobierania próbek zostanie zwizualizowane za pomocą diagramu Venna i testów nieparametrycznych stosowanych do oceny różnic między miejscami pobierania próbek.