Onderzoek van het microbioom van het hoornvlies bij microbiële keratitis (STOICA)

Microbiële keratitis (MK) is een oogheelkundig noodgeval dat kan leiden tot complicaties die het gezichtsvermogen bedreigen, zoals littekens op het hoornvlies, perforatie, endoftalmitis en uiteindelijk blindheid. De patiënt heeft agressieve topische antimicrobiële therapie nodig en nauwlettende monitoring van de respons op de behandeling, vaak inclusief ziekenhuisopname gevolgd door frequente poliklinische bezoeken.

Het verbeteren van de resultaten hangt af van het snel identificeren van het veroorzakende micro-organisme. Momenteel wordt het waarschijnlijke oorzakelijke micro-organisme slechts in ongeveer 30 tot 40% van de gevallen geïsoleerd met behulp van traditionele schraapmethoden en standaard conventionele diagnostische kweek (CDC), waarbij het doorgaans tot 4 dagen duurt voordat de clinicus de resultaten kan zien. Gevoeligere methoden zoals op micro-organismen gerichte polymerasekettingreactie (MTPCR) en metagenomische analyse vergroten het potentieel om micro-organismen te detecteren, maar kunnen de kans vergroten dat commensale micro-organismen worden opgepikt, waardoor het voor de behandelende arts moeilijk wordt om te interpreteren welk van de geïsoleerde organismen waarschijnlijk oorzakelijk zijn in MK.

Een van de belemmeringen voor het identificeren van de organismen was de moeilijkheid om monsters van het hoornvlies te verzamelen. In 2015 ontwikkelde een groep onder leiding van professor Kaye aan de Universiteit van Liverpool een niet-invasieve corneale bemonsteringsmethode met behulp van een cornea-afdrukmembraan (CIM) gemaakt van polytetrafluorethyleen. Dit bleek een aanzienlijk hoger totaal isolatiepercentage te hebben in vergelijking met conventionele schraapmethoden. Omdat het minimaal invasief is, biedt de CIM-bemonsteringsmethode een unieke kans om zowel het aangetaste hoornvlies als het niet-aangedane hoornvlies van patiënten met MK te bemonsteren, evenals de ogen van patiënten die niet door MK zijn aangetast. Dit zal een veel beter begrip mogelijk maken van de klinische betekenis van geïsoleerde organismen in MK.

Metagenomic next-generation sequencing (NGS) technieken maken de genomische analyse van alle microben in een monster mogelijk, wat een schat aan informatie oplevert over de aanwezigheid en interactie van micro-organismen, evenals de aan- of afwezigheid van antimicrobiële resistentie (AMR) genen. Eerdere studies die probeerden het microbioom van het oogoppervlak in gezondheid te karakteriseren met behulp van metagenomics, hebben een divers homeostatisch microbioom aangetoond, maar waren beperkt tot uitstrijkjes van het ooglid, het bindvlies en de tranen in plaats van het hoornvlies. Variaties in het microbioom zijn in verband gebracht met aandoeningen zoals het droge ogen-syndroom, het dragen van contactlenzen en infectieuze pathologieën, waaronder een pathologisch microbioom dat wordt gedomineerd door pseudomonas spp. bij een klein aantal patiënten met bacteriële keratitis. Ondanks dat het hoornvlies het oppervlak is dat door MK is aangetast, zijn er geen gegevens over het gezonde hoornvliesmicrobioom omdat traditionele bemonsteringsmethoden invasief zijn geweest.

Ondanks dat NGS binnen enkele uren gepersonaliseerde resultaten genereert, vormt de gevoeligheid ervan om alle aanwezige organismen te detecteren zonder hun klinische betekenis te begrijpen een belemmering voor de introductie ervan in de klinische praktijk. In dit project zullen de CIM-bemonsteringsmethode en NGS-verwerking worden gebruikt om het begrip van de veroorzakende organismen in MK te verbeteren. Bovendien zal, door bemonstering van zowel de aangetaste als de niet-aangetaste ogen van MK-patiënten en van degenen zonder MK, een diagnostische regel worden ontwikkeld om commensale organismen te identificeren en te verdisconteren. De opname van verschillende controlegroepen zal ook informatie opleveren over de invloed van contactlenzen en oogdruppels op het microbioom, die een rol spelen bij zowel de ontwikkeling als de behandeling van MK. Dit zal de huidige interpretatie van de resultaten van hoornvliesmonsters aanzienlijk vergemakkelijken en mogelijk toekomstig gebruik van NGS in de routinematige oogheelkundige klinische praktijk vergemakkelijken.

Doelstellingen en doelstellingen

Het algemene doel van het project is om de pathogene micro-organismen bij patiënten met MK beter te definiëren door een beter begrip van het hoornvliesmicrobioom bij gezondheid en ziekte.

Dit zal worden bereikt door middel van de volgende doelstellingen.

1. Analyseer met behulp van NGS het hoornvliesmicrobioom van het aangetaste en niet-aangedane oog van patiënten met en zonder MK en vergelijk met gelijktijdige resultaten van CDC en MTPCR.
2. Bepaal het microbiologische spectrum van het hoornvlies, oogoppervlak en aangrenzende structuren, bij patiënten met MK, gezonde controles, dragers van contactlenzen en gebruikers van oogdruppels.

Studie ontwerp:

Design: Prospectief observationeel diagnostisch onderzoek en methodevergelijking.

Studieduur: drie jaar.

Aantal en soort vakken:

Er zullen 151 patiënten met MK worden aangeworven. Dit is gebaseerd op de volgende berekening van de steekproefomvang: De huidige standaard diagnostische referentiemethode (CDM) heeft een diagnostische nauwkeurigheid van 40%. Voor klinische implementatie van NGS moet de diagnostische nauwkeurigheid worden verhoogd tot ten minste 80%. NGS kan het aandeel gedetecteerde micro-organismen alleen maar verhogen. Om een ​​diagnostisch percentage van 80% te schatten met een betrouwbaarheidsinterval van 95% (met een breedte van 15%) zijn 137 deelnemers nodig. Deze berekening gaat ervan uit dat de kleinste diagnostische groep een prevalentie heeft van 20%. Om rekening te houden met een percentage van 10% van mogelijk verlies van follow-up, zullen we 151 patiënten rekruteren.

We zullen ook 90 deelnemers werven voor vier controlegroepen:

1. 20 patiënten zonder voorgeschiedenis van MK die geen oogdruppelmedicatie gebruiken
2. 20 patiënten zonder voorgeschiedenis van MK die contactlenzen dragen
3. 20 patiënten die geen voorgeschiedenis van MK hebben maar een oogdruppelbehandeling ondergaan voor glaucoom. Deze groep is opgenomen om te beoordelen op veranderingen in het hoornvliesmicrobioom die secundair kunnen zijn aan het laten vallen van de behandeling.
4. Er zullen 30 patiënten met keratoconus worden gerekruteerd die crosslinking ondergaan. Bij deze deelnemers als onderdeel van de routinematige verknopingsprocedure wordt het hoornvliesepitheel verwijderd. Dit verwijderde epitheel van een verder gezond hoornvliesoppervlak zal een directe vergelijking mogelijk maken tussen het hoornvliesmicrobioom dat wordt gekarakteriseerd door de CIM en dat dat rechtstreeks wordt gekarakteriseerd door het epitheel.

Verzameling van klinische gegevens

Bij presentatie zullen demografische gegevens van de patiënt, risicofactoren (aandoening van het oogoppervlak, slijtage van contactlenzen, eerdere MK) en behandeling die in het verleden is ontvangen of gebruikt bij presentatie, worden verkregen uit een interview, samen met zweerkenmerken (grote en kleine assen van de hoornvlieszweer). gemeten met een continue schaal). Er zal gebruik worden gemaakt van een gestandaardiseerd gegevensverzamelingsformulier.

De best gecorrigeerde gezichtsscherpte (BCVA), grootte, locatie en diepte van de zweer zal worden vastgelegd met behulp van een spleetlampbiomicroscoop. De grootte van de zweer (kleine en grote as) en locatie (minimale afstand tot de limbus) worden gemeten. De diepte van de zweer wordt gemeten op een nominale schaal van 1-4 op basis van het percentage resterende dikte van het hoornvlies onder de zweer.

Specimenverzameling

Voor elke deelnemer worden de volgende monsters verzameld:

• Drie CIM's van de aangedane en niet-aangedane ogen van deelnemers met MK, of van één oog van controledeelnemers.
• Uitstrijkjes van bindvlies van de aangedane en onaangetaste ogen, bovenste oogleden en neus van de deelnemer.

Drie CIM's worden gedurende 5 seconden op het oppervlak van het hoornvlies aangebracht (PTFE Millipore-kweekinsert, poriegrootte 0,40 micrometer) en één CIM gedurende 5 seconden op de inferieure fornix conjunctiva van de deelnemer met behulp van steriele handschoenen. Een plaatselijke verdoving (één druppel 0,5% proxymethacaïne) zal in de onderste conjunctivale fornix worden gedruppeld voordat de CIM's worden aangebracht. Het eerste CIM-monster dat is verkregen van het hoornvlies van de deelnemer zal worden geplaatst en vervoerd in een fles met 0,5 ml BHI-bouillon voor kweek. De CIM's verkregen van het hoornvlies en de inferieure conjunctiva van de deelnemers worden droog bewaard in een steriele buis. Naast de beschreven verzameling van monsters, zal het hoornvliesepitheel dat is verwijderd van patiënten die hoornvliesvernetting ondergaan, in een steriele eppendorf worden geplaatst en bij -80 C worden bewaard. om het omringende microbioom en endogene bronnen te karakteriseren.

Follow-up van MK-deelnemers

Deelnemers die zich presenteren met een klinisch vermoeden van MK zullen 3 dagen, 7 dagen en 1 maand na presentatie worden gevolgd, volgens de normale procedure voor follow-up van MK. Bij elke vervolgafspraak worden BCVA, grootte en diepte van het ulcus genoteerd. Alle monsters worden herhaald bij elke vervolgafspraak van alleen het aangedane oog van de deelnemer. Deze omvatten drie corneale CIMS, conjunctivale, bovenste ooglid- en neusuitstrijkjes.

Verwerking van monsters en identificatie van micro-organismen:

1. CDC (gevestigde diagnostische standaard): Bloed-, chocolade- en Sabouraud's dextrose-agarplaten en een 24-uurs subcultuur van de BHI-bouillon geïnoculeerd met de bacteriële uitstrijkjes en membranen zullen worden onderzocht op tekenen van bacteriegroei na 24 en 48 uur incubatie.
2. MTPCR:DNA zal worden geëxtraheerd en gekwantificeerd uit de CIM en virologie conjunctivale uitstrijkjes. Een multiplex micro-organisme gerichte PCR (MTPCR) mastermix, inclusief primers voor HSV-1, HSV2, acanthamoeba, 16S en 18S ribosomaal DNA zal worden bereid en PCR zal worden uitgevoerd met behulp van een real-time PCR-instrument
3. NGS: Metagenomic-testen zullen worden uitgevoerd met behulp van high-throughput-platforms, zoals de Illumina HiSeq 4000. Sequentiediepte zal empirisch worden bepaald. Genoomuitlijning, filtering en pathogeenoproep zullen worden uitgevoerd met behulp van gevestigde pijplijnen. Voor de taxonomische classificatie zal een analysebenadering op basis van leesclassificatie worden toegepast. Er zal een subtractieve analysemethode worden toegepast, gebaseerd op verwijdering van gastheer-DNA en metagenoom van het gezonde controleoog.

Statistische analyse:

Een vergelijking van isolatiepercentages en geïdentificeerde bacteriën verkregen uit CDC-, MTPCR- en NGS-verwerking van MK-hoornvliesmonsters zal worden gemaakt. Dit wordt gevisualiseerd met behulp van een Venn-diagram.

Voor NGS-gegevens zullen we samenwerken met het Centre of Genomic Research (CGR) om taxonomielabels toe te wijzen en relatieve abundanties in elk monster te berekenen. Voor detectie van AMR zal software worden gebruikt om reads rechtstreeks in kaart te brengen met die in een uitgebreide AMR-database en de aanwezige AMR-genen te rapporteren.

Micro-organismen geïdentificeerd in de ogen met MK zullen vervolgens worden vergeleken met het controlecollega-oog en andere controlegroepen en subtractieve bioinformatica-methodologie zal worden toegepast om de meest waarschijnlijke pathogene organismen te identificeren in vergelijking met die in het gezonde hoornvliesmicrobioom.

Vergelijkingen van de relatieve hoeveelheid micro-organismen verkregen uit MK-hoornvliesmonsters tijdens de follow-upbezoeken van de deelnemer zullen worden gebruikt om longitudinale veranderingen in het hoornvliesmicrobioom tijdens de behandeling en resolutie van MK te evalueren.

Er zal een directe vergelijking worden gemaakt tussen de relatieve overvloed aan micro-organismen geïsoleerd uit het hoornvlies, het bindvlies, de oogleden en de neus van deelnemers om mogelijke endogene bronnen van infectie voor MK te identificeren. Overlappingen van micro-organismen tussen de monsterlocaties zullen worden gevisualiseerd met behulp van een Venn-diagram en niet-parametrische tests die worden gebruikt om te beoordelen op verschillen tussen de monsterlocaties.