Vyšetřování mikrobiomu rohovky u mikrobiální keratitidy (STOICA)

Mikrobiální keratitida (MK) je oftalmologický stav, který může vést ke komplikacím ohrožujícím zrak, jako je zjizvení rohovky, perforace, endoftalmitida a nakonec slepota. Pacient vyžaduje agresivní lokální antimikrobiální léčbu a pečlivé sledování odpovědi na léčbu, často včetně hospitalizace s následnými častými ambulantními návštěvami.

Zlepšení výsledků závisí na rychlé identifikaci původce mikroorganismu. V současné době je pravděpodobný kauzální mikroorganismus izolován pouze v přibližně 30 až 40 % případů pomocí tradičních metod škrábání a standardní konvenční diagnostické kultury (CDC), přičemž výsledky obvykle trvá až 4 dny, než jsou klinickému lékaři k dispozici. Citlivější metody, jako je polymerázová řetězová reakce cílená na mikroorganismy (MTPCR) a metagenomická analýza, zvyšují potenciál detekce mikroorganismů, ale mohou zvýšit pravděpodobnost zachycení komenzálních mikroorganismů, což ztěžuje ošetřujícímu lékaři interpretovat, který z izolovaných organismů pravděpodobně dokáže být kauzální v MK.

Jednou z překážek při identifikaci organismů byla obtížnost odběru vzorků z rohovky. V roce 2015 skupina vedená profesorem Kayem z University of Liverpool vyvinula neinvazivní metodiku odběru vzorků rohovky pomocí rohovkové impresní membrány (CIM) vyrobené z polytetrafluorethylenu. Ukázalo se, že to má výrazně vyšší celkovou míru izolace ve srovnání s konvenčními metodami škrábání. Vzhledem k tomu, že metoda odběru CIM je minimálně invazivní, nabízí jedinečnou možnost odběru vzorků z postižené i nepostižené rohovky pacientů s MK i očí pacientů nepostižených MK. To umožní mnohem lépe pochopit klinický význam izolovaných organismů u MK.

Techniky metagenomického sekvenování nové generace (NGS) umožňují genomickou analýzu všech mikrobů ve vzorku, což poskytuje množství informací týkajících se přítomnosti a interakce mikroorganismů a také přítomnosti nebo nepřítomnosti genů antimikrobiální rezistence (AMR). Předchozí studie pokoušející se charakterizovat mikrobiom očního povrchu ve zdraví pomocí metagenomiky prokázaly různorodý rezidentní homeostatický mikrobiom, avšak byly omezeny na výtěry odebrané z víčka, spojivky a slz spíše než z rohovky. Variace v mikrobiomu byly spojeny se stavy, jako je syndrom suchého oka, nošení kontaktních čoček a infekční patologie, včetně patologického mikrobiomu, kterému dominují pseudomonas spp. u malého počtu pacientů s bakteriální keratitidou. Přestože je rohovka povrchem postiženým MK, neexistují žádné údaje týkající se zdravého mikrobiomu rohovky, protože tradiční metody odběru vzorků byly invazivní.

Navzdory tomu, že NGS generuje personalizované výsledky během několika hodin, jeho citlivost k detekci všech přítomných organismů bez pochopení jejich klinického významu je překážkou jeho zavedení do klinické praxe. V tomto projektu bude použita metoda vzorkování CIM a zpracování NGS ke zlepšení porozumění příčinným organismům v MK. Kromě toho bude prostřednictvím odběru vzorků z postižených i nepostižených očí pacientů s MK a od těch bez MK vyvinuto diagnostické pravidlo pro identifikaci a vyloučení komenzálních organismů. Zařazení různých kontrolních skupin také poskytne informace o vlivu kontaktních čoček a očních kapek na mikrobiom, které mají roli jak ve vývoji, tak v léčbě MK. To značně usnadní současnou interpretaci výsledků vzorků rohovky a usnadní potenciální budoucí použití NGS v běžné oftalmologické klinické praxi.

Cíle a záměry

Celkovým cílem projektu je lépe definovat patogenní mikroorganismy u pacientů s MK prostřednictvím lepšího pochopení rohovkového mikrobiomu ve zdraví a nemoci.

Toho bude dosaženo prostřednictvím následujících cílů.

1. Pomocí NGS analyzujte mikrobiom rohovky postiženého a nepostiženého oka pacientů s MK a bez MK a porovnejte se současnými výsledky z CDC a MTPCR.
2. Stanovte mikrobiologické spektrum rohovky, povrchu oka a přilehlých struktur, u pacientů s MK, zdravých kontrol, nositelů kontaktních čoček a uživatelů očních kapek.

Studovat design:

Typ studie: Prospektivní observační diagnostická studie a metody-srovnání.

Délka studia: Tři roky.

Počet a typ předmětů:

Bude přijato 151 pacientů s MK. To je založeno na následujícím výpočtu velikosti vzorku: Současná standardní diagnostická referenční metoda (CDM) má diagnostickou přesnost 40 %. Pro klinickou implementaci NGS bude vyžadováno zvýšení diagnostické přesnosti alespoň na 80 %. NGS může pouze zvýšit podíl detekovaných mikroorganismů. K odhadu diagnostické míry 80 % s 95% intervalem spolehlivosti (šířka 15 %) je zapotřebí 137 účastníků. Tento výpočet předpokládá, že nejmenší diagnostická skupina má prevalenci 20 %. Abychom se přizpůsobili 10% míře možné ztráty sledování, přijmeme 151 pacientů.

Přijmeme také 90 účastníků do čtyř kontrolních skupin:

1. 20 pacientů bez anamnézy MK, kteří neužívají žádné oční kapky
2. 20 pacientů bez anamnézy MK, kteří nosí kontaktní čočky
3. 20 pacientů, kteří nemají v anamnéze MK, ale jsou na léčbě očními kapkami pro glaukom. Tato skupina byla zahrnuta, aby vyhodnotila změny v mikrobiomu rohovky, které by mohly být sekundární po kapkové léčbě.
4. Bude přijato 30 pacientů s keratokonem, kteří podstupují cross-linking. Těmto účastníkům bude v rámci rutinního postupu zesíťování odstraněn jejich rohovkový epitel. Takto odstraněný epitel z jinak zdravého povrchu rohovky umožní přímé srovnání mezi rohovkovým mikrobiomem charakterizovaným z CIM a mikrobiomem charakterizovaným přímo z epitelu.

Sběr klinických dat

Při prezentaci budou z rozhovoru získány demografické údaje pacienta, rizikové faktory (onemocnění očního povrchu, nošení kontaktních čoček, předchozí MK) a léčba v minulosti nebo užívaná při prezentaci spolu s charakteristikami vředu (hlavní a vedlejší osy vředu rohovky měřeno pomocí spojité stupnice). Bude použit standardizovaný formulář pro sběr dat.

Nejlepší korigovaná zraková ostrost (BCVA), velikost, umístění a hloubka vředu budou zaznamenány pomocí biomikroskopu se štěrbinovou lampou. Bude měřena velikost vředu (vedlejší a hlavní osy) a umístění (minimální vzdálenost od limbu). Hloubka vředu bude měřena na nominální stupnici 1-4 na základě procenta zbývající tloušťky rohovky pod vředem.

Sbírka vzorků

Pro každého účastníka budou odebrány následující vzorky:

• Tři CIM z postižených a nepostižených očí účastníků s MK nebo z jednoho oka účastníků kontroly.
• Výtěry ze spojivek postižených a nepostižených očí, horních víček a nosu účastníka.

Tři CIM budou aplikovány (PTFE Millipore kultivační vložka, velikost pórů 0,40 mikrometru) na povrch rohovky po dobu 5 sekund a jedna CIM na dolní fornix spojivku účastníků po dobu 5 sekund pomocí sterilních rukavic. Před aplikací CIM bude do dolního spojivkového fornixu instilováno topické anestetikum (jedna kapka 0,5% proxymethacainu). První vzorek CIM získaný z rohovky účastníků bude umístěn a transportován do lahvičky obsahující 0,5 ml BHI bujónu pro kultivaci. CIM získané z rohovky a dolní spojivky účastníků budou udržovány v suchu ve sterilní zkumavce. Kromě odběru popsaných vzorků bude rohovkový epitel odebraný pacientům podstupujícím zesíťování rohovky umístěn do sterilní eppendorfky a skladován při -80 C. Účastníkovi budou odebrány výtěry ze spojivky, horních víček a předních nosů v pořadí. charakterizovat okolní mikrobiom a endogenní zdroje.

Účastník MK navazovat

Účastníci s klinicky suspektní MK budou sledováni 3 dny, 7 dnů a 1 měsíc po prezentaci, podle normálního postupu pro sledování MK. Při každé kontrole BCVA bude zaznamenána velikost a hloubka vředu. Všechny vzorky budou opakovány při každé kontrolní schůzce pouze z postiženého oka účastníků. Ty budou zahrnovat tři CIMS rohovky, výtěry spojivky, horního víčka a nosu.

Zpracování vzorků a identifikace mikroorganismů:

1. CDC (zavedený diagnostický standard): Krevní, čokoládové a Sabouraudovy dextrózové agarové plotny a 24hodinová subkultura BHI bujónu naočkovaného bakteriálními tampony a membránami budou zkoumány na důkazy bakteriálního růstu po 24 a 48 hodinách inkubace.
2. MTPCR:DNA bude extrahována a kvantifikována z CIM a virologického výtěru spojivek. Připraví se master mix pro multiplexní mikroorganismy cílené PCR (MTPCR), včetně primerů pro HSV-1, HSV2, acanthamoeba, 16S a 18S ribozomální DNA a provede se PCR pomocí nástroje real-time PCR
3. NGS: Metagenomické testování bude prováděno pomocí vysoce výkonných platforem, jako je Illumina HiSeq 4000. Hloubka sekvenování bude určena empiricky. Zarovnání genomu, filtrování a volání patogenů bude provedeno pomocí zavedených kanálů. Pro taxonomickou klasifikaci bude aplikován analytický přístup založený na klasifikaci čtení. Bude aplikována metoda subtraktivní analýzy založená na odstranění hostitelské DNA a metagenomu zdravého kontrolního oka.

Statistická analýza:

Bude provedeno srovnání míry izolace a identifikovaných bakterií získaných ze zpracování CDC, MTPCR a NGS vzorků rohovky MK. To bude vizualizováno pomocí Vennova diagramu.

U dat NGS budeme spolupracovat s Centrem genomického výzkumu (CGR) na přiřazení značek taxonomie a výpočtu relativních četností v každém vzorku. Pro detekci AMR bude použit software k přímému mapování čtení na ty v komplexní databázi AMR a hlášení přítomných AMR genů.

Mikroorganismy identifikované v očích pomocí MK budou poté porovnány s kontrolním okem a dalšími kontrolními skupinami a metoda subtraktivní bioinformatiky bude použita k identifikaci nejpravděpodobnějších patogenních organismů ve srovnání s organismy pozorovanými ve zdravém mikrobiomu rohovky.

Srovnání relativního množství mikroorganismů získaných ze vzorků rohovky MK během kontrolních návštěv účastníka bude použito k hodnocení longitudinálních změn v mikrobiomu rohovky během léčby a vymizení MK.

Bude provedeno přímé srovnání mezi relativním množstvím mikroorganismů izolovaných z rohovky, spojivky, očních víček a nosu účastníků, aby se identifikovaly možné endogenní zdroje infekce pro MK. Překryvy mikroorganismů mezi místy vzorku budou vizualizovány pomocí Vennova diagramu a neparametrických testů použitých k posouzení rozdílů mezi místy vzorku.