Undersøkelse av mikrobiomet i hornhinnen ved mikrobiell keratitt (STOICA)

Mikrobiell keratitt (MK) er en oftalmologisk nødsituasjon som kan føre til synstruende komplikasjoner som arrdannelse i hornhinnen, perforering, endoftalmitt og til slutt blindhet. Pasienten krever aggressiv topikal antimikrobiell behandling og tett overvåking av behandlingsrespons, ofte inkludert sykehusinnleggelse etterfulgt av hyppige polikliniske besøk.

Forbedring av utfall avhenger av rask identifisering av den forårsakende mikroorganismen. Foreløpig er den sannsynlige forårsakende mikroorganismen bare isolert i rundt 30 til 40 % av tilfellene ved bruk av tradisjonelle skrapemetoder og standard konvensjonell diagnostisk kultur (CDC), med resultater som vanligvis tar opptil 4 dager før de blir tilgjengelige for klinikeren. Mer sensitive metoder som mikroorganismemålrettet polymerasekjedereaksjon (MTPCR) og metagenomisk analyse øker potensialet for å oppdage mikroorganismer, men kan øke sannsynligheten for å plukke opp kommensale mikroorganismer, noe som gjør det vanskelig for behandlende kliniker å tolke hvilken av de isolerte organismene som sannsynligvis vil være kausativ i MK.

En av barrierene for å identifisere organismene har vært vanskeligheten med å samle prøver fra hornhinnen. I 2015 utviklet en gruppe ledet av professor Kaye ved University of Liverpool en ikke-invasiv hornhinneprøvetakingsmetodikk ved bruk av en hornhinneavtrykksmembran (CIM) laget av polytetrafluoretylen. Dette ble vist å ha en betydelig høyere total isolasjonsrate sammenlignet med konvensjonelle skrapemetoder. Siden den er minimalt invasiv, tilbyr CIM-prøvetakingsmetoden en unik mulighet til å ta prøver av både den berørte hornhinnen og upåvirket hornhinne hos pasienter med MK, samt øynene til pasienter som ikke er påvirket av MK. Dette vil muliggjøre en mye bedre forståelse av den kliniske betydningen av isolerte organismer i MK.

Metagenomiske neste generasjons sekvenseringsteknikker (NGS) muliggjør genomisk analyse av alle mikrobene i en prøve, og gir et vell av informasjon om tilstedeværelse og interaksjon av mikroorganismer samt tilstedeværelse eller fravær av gener for antimikrobiell resistens (AMR). Tidligere studier som forsøkte å karakterisere det okulære overflatemikrobiomet i helse ved hjelp av metagenomikk har vist et mangfoldig hjemmeostatisk mikrobiom, men har vært begrenset til vattpinner tatt fra lokket, konjunktiva og tårer i stedet for hornhinnen. Variasjoner i mikrobiomet har vært assosiert med tilstander som tørre øyne-syndrom, kontaktlinsebruk og smittsomme patologier, inkludert et patologisk mikrobiom dominert av pseudomonas spp. hos et lite antall pasienter med bakteriell keratitt. Til tross for at hornhinnen er overflaten som er påvirket av MK, er det ingen data angående det sunne hornhinnemikrobiomet fordi tradisjonelle prøvetakingsmetoder har vært invasive.

Til tross for at NGS genererer personaliserte resultater i løpet av få timer, er dens følsomhet for å oppdage alle organismer som er tilstede uten en forståelse av deres kliniske betydning en barriere for introduksjonen i klinisk praksis. I dette prosjektet vil CIM prøvetakingsmetoden og NGS prosessering bli brukt for å forbedre forståelsen av de forårsakende organismene i MK. Videre, gjennom prøvetaking av både de berørte og upåvirkede øynene til MK-pasienter og fra de uten MK, vil det utvikles en diagnostisk regel for å identifisere og diskontere kommensale organismer. Inkludering av ulike kontrollgrupper vil også gi informasjon om påvirkning av kontaktlinser og øyedråper på mikrobiomet, som har en rolle både for utvikling og behandling av MK. Dette vil i stor grad lette nåværende tolkning av hornhinneprøveresultater og lette potensiell fremtidig bruk av NGS i rutinemessig oftalmisk klinisk praksis.

Mål og målsetninger

Det overordnede målet med prosjektet er å bedre definere de patogene mikroorganismene hos pasienter med MK gjennom en bedre forståelse av hornhinnemikrobiomet i helse og sykdom.

Dette vil bli oppnådd gjennom følgende mål.

1. Ved å bruke NGS, analyser hornhinnemikrobiomet til det berørte og upåvirkede øyet til pasienter med og uten MK og sammenlign med samtidige resultater fra CDC og MTPCR.
2. Bestem det mikrobiologiske spekteret av hornhinnen, øyeoverflaten og tilstøtende strukturer, hos pasienter med MK, friske kontroller, kontaktlinsebrukere og øyedråperbrukere.

Studere design:

Design: Prospektiv observasjonsdiagnostisk studie og metode-sammenligning.

Studietid: Tre år.

Antall og type fag:

151 pasienter med MK skal rekrutteres. Dette er basert på følgende prøvestørrelsesberegning: Gjeldende standard diagnostisk referansemetode (CDM) har en diagnostisk nøyaktighet på 40 %. For klinisk implementering av NGS vil diagnostisk nøyaktighet være nødvendig å øke til minst 80 %. NGS kan bare øke andelen påviste mikroorganismer. For å estimere en diagnostisk rate på 80 % med et 95 % konfidensintervall (med bredde 15 %) kreves det 137 deltakere. Denne beregningen forutsetter at den minste diagnosegruppen har en prevalens på 20 %. For å justere for en 10 % rate av mulig tap av oppfølging, vil vi rekruttere 151 pasienter.

Vi skal også rekruttere 90 deltakere til fire kontrollgrupper:

1. 20 pasienter uten historie med MK som ikke bruker øyedråpemedisiner
2. 20 pasienter uten historie med MK som er kontaktlinsebrukere
3. 20 pasienter som ikke har MK i anamnesen, men som er på øyedråpebehandling for glaukom. Denne gruppen har blitt inkludert for å vurdere endringer i hornhinnemikrobiomet som kan være sekundære til droppbehandling.
4. 30 pasienter med keratokonus som gjennomgår kryssbinding skal rekrutteres. Disse deltakerne som en del av den rutinemessige tverrbindingsprosedyren vil få hornhinneepitel fjernet. Dette fjernede epitelet fra en ellers sunn hornhinneoverflate vil tillate en direkte sammenligning mellom hornhinnemikrobiomet karakterisert fra CIM og det som karakteriseres direkte fra epitelet.

Innsamling av klinisk data

Ved presentasjonen vil pasientdemografi, risikofaktorer (øyesykdom, kontaktlinsebruk, tidligere MK) og behandling mottatt tidligere eller ved presentasjon innhentes fra intervju, sammen med sårkarakteristikker (hoved- og mindreakser i hornhinnesåret målt med en kontinuerlig skala). Det vil bli benyttet et standardisert datainnsamlingsskjema.

Best korrigert synsskarphet (BCVA), størrelse, plassering og dybde av såret vil bli registrert ved hjelp av et spaltelampebiomikroskop. Sårstørrelse (mindre og større akser) og plassering (minimumsavstand fra limbus) vil bli målt. Sårdybden vil bli målt på en nominell skala fra 1-4 basert på prosentandelen av gjenværende hornhinnetykkelse under såret.

Prøvesamling

For hver deltaker vil det bli samlet inn følgende prøver:

• Tre CIM-er fra de berørte og upåvirkede øynene til deltakere med MK, eller fra ett øye til kontrolldeltakerne.
• Vatpinner fra konjunktiva av deltakerens berørte og upåvirkede øyne, øvre øyelokk og nese.

Tre CIM-er vil bli påført (PTFE Millipore kulturinnsats, porestørrelse 0,40 mikrometer) på overflaten av hornhinnen i 5 sekunder og en CIM på deltakernes inferior fornix conjunctiva i 5 sekunder ved bruk av sterile hansker. Et lokalt bedøvelsesmiddel (én dråpe 0,5 % proxymetakain) vil bli instillert i den nedre konjunktivale fornix før påføring av CIM-ene. Den første CIM-prøven oppnådd fra deltakernes hornhinne vil bli plassert og transportert i en flaske som inneholder 0,5 ml BHI-buljong for dyrking. CIM-ene oppnådd fra deltakernes hornhinne og den nedre konjunktiva vil bli holdt tørre i et sterilt rør. I tillegg til prøvesamlingen som er beskrevet, vil hornhinneepitelet som er fjernet fra pasienter som gjennomgår korneal kryssbinding, plasseres i en steril eppendorf og oppbevares ved -80 C. Vatter vil bli tatt fra deltakerens bindehinne, øvre øyelokk og fremre nese i rekkefølge å karakterisere det omkringliggende mikrobiomet og endogene kilder.

MK deltaker oppfølging

Deltakere som presenterer med klinisk mistenkt MK vil bli fulgt opp 3 dager, 7 dager og 1 måned etter presentasjon, i henhold til normal prosedyre for oppfølging av MK. Ved hver oppfølgingsavtale vil BCVA, størrelse og dybde på såret bli registrert. Alle prøver vil bli gjentatt ved hver oppfølgingsavtale kun fra deltakernes berørte øye. Disse vil inkludere tre hornhinne-CIMS, konjunktival, øvre øyelokk og neseprøver.

Behandling av prøver og identifikasjon av mikroorganismer:

1. CDC (etablert diagnostisk standard): Blod-, sjokolade- og Sabourauds dekstroseagarplater og en 24-timers subkultur av BHI-buljongen inokulert med bakterieprøvene og membranene vil bli undersøkt for tegn på bakterievekst etter 24 og 48 timers inkubasjon.
2. MTPCR:DNA vil bli ekstrahert og kvantifisert fra CIM og virologi konjunktival vattpinne. En multipleks mikroorganismemålrettet PCR (MTPCR) masterblanding, inkludert primere for HSV-1, HSV2, acanthamoeba, 16S og 18S ribosomalt DNA vil bli klargjort og PCR utført ved bruk av et sanntids PCR-instrument
3. NGS: Metagenomisk testing vil bli utført ved hjelp av plattformer med høy gjennomstrømning, slik som Illumina HiSeq 4000. Sekvenseringsdybde vil bli bestemt empirisk. Genomjusteringer, filtrering og patogenkalling vil bli utført ved bruk av etablerte rørledninger. En analysetilnærming basert på lest klassifisering vil bli brukt for taksonomisk klassifisering. En subtraktiv analysemetode basert på fjerning av verts-DNA og sunt kontrolløyemetagenom vil bli brukt.

Statistisk analyse:

En sammenligning av isolasjonshastigheter og identifiserte bakterier hentet fra CDC, MTPCR og NGS prosessering av MK hornhinneprøver vil bli gjort. Dette vil bli visualisert ved hjelp av et Venn-diagram.

For NGS-data vil vi samarbeide med Center of Genomic Research (CGR) for å tildele taksonomimerker og beregne relative mengder i hver prøve. For påvisning av AMR vil programvare bli brukt til å kartlegge lesninger direkte til de i en omfattende AMR-database og rapportere AMR-genene som er tilstede.

Mikroorganismer identifisert i øynene med MK vil deretter bli sammenlignet med kontrollgruppen med øye og andre kontrollgrupper og subtraktiv bioinformatikkmetodikk brukt for å identifisere de mest sannsynlige patogene organismene sammenlignet med de som sees i det friske hornhinnemikrobiomet.

Sammenligninger av den relative mengden av mikroorganismer oppnådd fra MK-hornhinneprøver over deltakeroppfølgingsbesøkene vil bli brukt til å evaluere langsgående endringer i hornhinnemikrobiomet under behandling og oppløsning av MK.

En direkte sammenligning mellom den relative mengden av mikroorganismer isolert fra deltakernes hornhinne, konjunktiva, øyelokk og nese vil bli gjort for å identifisere mulige endogene infeksjonskilder for MK. Overlapping av mikroorganismer mellom prøvestedene vil bli visualisert ved hjelp av et Venn-diagram og ikke-parametriske tester som brukes for å vurdere forskjeller mellom prøvestedene.