Investigação do Microbioma da Córnea na Ceratite Microbiana (STOICA)

A ceratite microbiana (MK) é uma emergência oftalmológica que pode levar a complicações que ameaçam a visão, como cicatrização da córnea, perfuração, endoftalmite e, finalmente, cegueira. O paciente requer terapia antimicrobiana tópica agressiva e monitoramento rigoroso da resposta ao tratamento, muitas vezes incluindo hospitalização seguida de visitas ambulatoriais frequentes.

A melhoria dos resultados depende da identificação rápida do microrganismo causador. Atualmente, o provável microrganismo causador é isolado apenas em cerca de 30 a 40% dos casos, usando métodos tradicionais de raspagem e cultura de diagnóstico convencional padrão (CDC), com resultados normalmente levando até 4 dias para ficarem disponíveis para o clínico. Métodos mais sensíveis, como reação em cadeia da polimerase direcionada a microrganismos (MTPCR) e análise metagenômica, aumentam o potencial para detectar microrganismos, mas podem aumentar a probabilidade de detectar microrganismos comensais, tornando difícil para o médico assistente interpretar qual dos organismos isolados provavelmente irá ser causativo em MK.

Uma das barreiras para identificar os organismos tem sido a dificuldade em coletar amostras da córnea. Em 2015, um grupo liderado pelo professor Kaye da Universidade de Liverpool desenvolveu uma metodologia não invasiva de amostragem da córnea usando uma membrana de impressão da córnea (CIM) feita de politetrafluoretileno. Isso demonstrou ter uma taxa de isolamento geral significativamente maior em comparação com os métodos convencionais de raspagem. Por ser minimamente invasivo, o método de amostragem CIM oferece uma oportunidade única de coletar amostras tanto da córnea afetada quanto da córnea não afetada de pacientes com MK, bem como dos olhos de pacientes não afetados por MK. Isso permitirá uma compreensão muito melhor do significado clínico de organismos isolados em MK.

As técnicas de sequenciamento de próxima geração metagenômica (NGS) permitem a análise genômica de todos os micróbios em uma amostra, fornecendo uma riqueza de informações sobre a presença e interação de microrganismos, bem como a presença ou ausência de genes de resistência antimicrobiana (AMR). Estudos anteriores que tentaram caracterizar o microbioma da superfície ocular em saúde usando metagenômica demonstraram um microbioma homeostático residente diversificado, no entanto, limitaram-se a zaragatoas retiradas da pálpebra, conjuntiva e lágrimas, em vez da córnea. Variações no microbioma têm sido associadas a condições como a síndrome do olho seco, uso de lentes de contato e patologias infecciosas, incluindo um microbioma patológico dominado por pseudomonas spp. em um pequeno número de pacientes com ceratite bacteriana. Apesar da córnea ser a superfície afetada pelo MK, não há dados sobre o microbioma saudável da córnea porque os métodos tradicionais de amostragem têm sido invasivos.

Apesar do NGS gerar resultados personalizados em questão de horas, sua sensibilidade para detectar todos os organismos presentes sem a compreensão de seu significado clínico é uma barreira para sua introdução na prática clínica. Neste projeto, o método de amostragem CIM e o processamento NGS serão usados ​​para melhorar a compreensão dos organismos causadores em MK. Além disso, por meio da amostragem de olhos afetados e não afetados de pacientes com MK e daqueles sem MK, uma regra de diagnóstico será desenvolvida para identificar e descartar organismos comensais. A inclusão de diferentes grupos de controle também fornecerá informações sobre a influência de lentes de contato e colírios no microbioma, que têm papel tanto no desenvolvimento quanto no tratamento de MK. Isso facilitará muito a interpretação atual dos resultados da amostra da córnea e facilitará o uso futuro potencial de NGS na prática clínica oftalmológica de rotina.

Propósitos e objectivos

O objetivo geral do projeto é definir melhor os microrganismos patogênicos em pacientes com MK por meio de uma melhor compreensão do microbioma da córnea na saúde e na doença.

Isso será alcançado através dos seguintes objetivos.

1. Usando NGS, analise o microbioma da córnea do olho afetado e não afetado de pacientes com e sem MK e compare com resultados simultâneos de CDC e MTPCR.
2. Determinar o espectro microbiológico da córnea, superfície ocular e estruturas contíguas, em pacientes com MK, controles saudáveis, usuários de lentes de contato e usuários de colírios.

Design de estudo:

Delineamento: Estudo diagnóstico observacional prospectivo e comparação de métodos.

Duração do estudo: Três anos.

Número e tipo de disciplinas:

Serão recrutados 151 pacientes com MK. Isso se baseia no seguinte cálculo de tamanho de amostra: O método de referência de diagnóstico padrão (CDM) atual tem uma precisão de diagnóstico de 40%. Para implementação clínica de NGS, a precisão diagnóstica deverá aumentar para pelo menos 80%. O NGS só pode aumentar a proporção de microrganismos detectados. Para estimar uma taxa de diagnóstico de 80% com um intervalo de confiança de 95% (com largura de 15%) são necessários 137 participantes. Este cálculo assume que o menor grupo diagnóstico tem uma prevalência de 20%. Para ajustar uma taxa de 10% de possível perda de seguimento, recrutaremos 151 pacientes.

Também recrutaremos 90 participantes para quatro grupos de controle:

1. 20 pacientes sem história de MK que não fazem uso de colírios
2. 20 pacientes sem história de MK que usam lentes de contato
3. 20 pacientes que não têm histórico de MK, mas estão em tratamento com colírio para glaucoma. Este grupo foi incluído para avaliar as alterações no microbioma da córnea que podem ser secundárias ao tratamento com gotas.
4. Serão recrutados 30 pacientes com ceratocone submetidos a cross-linking. Esses participantes, como parte do procedimento rotineiro de reticulação, terão seu epitélio corneano removido. Este epitélio removido de uma superfície corneana saudável permitirá uma comparação direta entre o microbioma corneano caracterizado a partir do CIM e aquele caracterizado diretamente a partir do epitélio.

Coleta de dados clínicos

Na apresentação, dados demográficos do paciente, fatores de risco (doença da superfície ocular, uso de lentes de contato, MK anterior) e tratamento recebido no passado ou em uso na apresentação serão obtidos da entrevista, juntamente com as características da úlcera (eixos maiores e menores da úlcera de córnea medida usando uma escala contínua). Será utilizado um formulário padronizado de coleta de dados.

A melhor acuidade visual corrigida (BCVA), tamanho, localização e profundidade da úlcera serão registrados usando um biomicroscópio de lâmpada de fenda. O tamanho da úlcera (eixos menor e maior) e a localização (distância mínima do limbo) serão medidos. A profundidade da úlcera será medida em uma escala nominal de 1-4 com base na porcentagem da espessura restante da córnea sob a úlcera.

Coleta de amostras

Para cada participante, as seguintes amostras serão coletadas:

• Três CIMs dos olhos afetados e não afetados dos participantes com MK ou de um olho dos participantes do controle.
• Swabs da conjuntiva dos olhos afetados e não afetados do participante, pálpebras superiores e nariz.

Três CIMs serão aplicados (inserção de cultura PTFE Millipore, tamanho de poro 0,40 micrômetros) na superfície da córnea por 5 segundos e um CIM no fornix conjuntiva inferior dos participantes por 5 segundos usando luvas estéreis. Um anestésico tópico (uma gota de proxymetacaína a 0,5%) será instilado no fórnice conjuntival inferior antes da aplicação dos CIMs. A primeira amostra de CIM obtida da córnea do participante será colocada e transportada em um frasco contendo 0,5mL de caldo BHI para cultura. Os CIMs obtidos da córnea e da conjuntiva inferior dos participantes serão mantidos secos em um tubo estéril. Além da coleta das amostras descritas, o epitélio corneano retirado de pacientes submetidos à reticulação corneana será colocado em um eppendorf estéril e armazenado a -80 C. Swabs serão colhidos da conjuntiva, pálpebras superiores e narinas anteriores do participante para caracterizar o microbioma circundante e as fontes endógenas.

Acompanhamento do participante MK

Os participantes que apresentarem suspeita clínica de MK serão acompanhados em 3 dias, 7 dias e 1 mês após a apresentação, conforme procedimento normal para acompanhamento de MK. Em cada consulta de acompanhamento, a BCVA, o tamanho e a profundidade da úlcera serão registrados. Todas as amostras serão repetidas em cada consulta de acompanhamento apenas do olho afetado do participante. Estes incluirão três CIMS da córnea, conjuntival, pálpebra superior e zaragatoas nasais.

Processamento de amostras e identificação de microrganismos:

1. CDC (padrão de diagnóstico estabelecido): Placas de ágar sangue, chocolate e dextrose Sabouraud e uma subcultura de 24 horas do caldo BHI inoculado com os swabs bacterianos e membranas serão examinadas quanto à evidência de crescimento bacteriano após 24 e 48 horas de incubação.
2. MTPCR:DNA será extraído e quantificado do swab conjuntival de CIM e virologia. Um master mix de PCR direcionado a micro-organismos multiplex (MTPCR), incluindo primers para HSV-1, HSV2, acanthamoeba, DNA ribossômico 16S e 18S será preparado e a PCR realizada usando um instrumento de PCR em tempo real
3. NGS: O teste de metagenômica será realizado usando plataformas de alto rendimento, como o Illumina HiSeq 4000. A profundidade de sequenciamento será determinada empiricamente. Alinhamentos de genoma, filtragem e chamada de patógenos serão realizados usando pipelines estabelecidos. Uma abordagem de análise baseada na classificação de leitura será aplicada para a classificação taxonômica. Será aplicado um método de análise subtrativo baseado na remoção do DNA do hospedeiro e metagenoma do olho de controle saudável.

Análise estatística:

Será feita uma comparação das taxas de isolamento e bactérias identificadas obtidas a partir do processamento de CDC, MTPCR e NGS de amostras de córnea MK. Isso será visualizado usando um diagrama de Venn.

Para dados NGS, trabalharemos com o Centro de Pesquisa Genômica (CGR) para atribuir rótulos de taxonomia e calcular abundâncias relativas em cada amostra. Para detecção de AMR, o software será usado para mapear leituras diretamente para aqueles em um banco de dados AMR abrangente e relatar os genes AMR presentes.

Os microrganismos identificados nos olhos com MK serão então comparados com o outro olho de controle e outros grupos de controle e a metodologia de bioinformática subtrativa aplicada para identificar os organismos patogênicos mais prováveis ​​em comparação com aqueles observados no microbioma saudável da córnea.

Comparações da abundância relativa de microorganismos obtidos de amostras de córnea MK durante as visitas de acompanhamento dos participantes serão usadas para avaliar mudanças longitudinais no microbioma da córnea durante o tratamento e resolução de MK.

Uma comparação direta entre a abundância relativa de microorganismos isolados da córnea, conjuntiva, pálpebras e nariz dos participantes será feita para identificar possíveis fontes endógenas de infecção para MK. As sobreposições de microorganismos entre os locais de amostragem serão visualizadas usando um diagrama de Venn e testes não paramétricos usados ​​para avaliar as diferenças entre os locais de amostragem.