Undersökning av mikrobiomet i hornhinnan vid mikrobiell keratit (STOICA)

Mikrobiell keratit (MK) är en oftalmologisk nödsituation som kan leda till synshotande komplikationer såsom ärrbildning i hornhinnan, perforering, endoftalmit och i slutändan blindhet. Patienten behöver aggressiv topikal antimikrobiell terapi och noggrann övervakning av behandlingssvar, ofta inklusive sjukhusvistelse följt av frekventa polikliniska besök.

Förbättring av resultat beror på att den orsakande mikroorganismen snabbt identifieras. För närvarande isoleras den sannolikt orsakande mikroorganismen endast i cirka 30 till 40 % av fallen med traditionella skrapningsmetoder och standard konventionell diagnostisk kultur (CDC), med resultat som vanligtvis tar upp till 4 dagar att bli tillgängliga för läkaren. Mer känsliga metoder som mikroorganismmålinriktad polymeraskedjereaktion (MTPCR) och metagenomisk analys ökar potentialen att upptäcka mikroorganismer men kan öka sannolikheten för att fånga upp kommensala mikroorganismer, vilket gör det svårt för den behandlande läkaren att tolka vilken av de isolerade organismerna som sannolikt kommer att vara orsakande i MK.

Ett av hindren för att identifiera organismerna har varit svårigheten att samla in prover från hornhinnan. 2015 utvecklade en grupp under ledning av professor Kaye vid University of Liverpool en icke-invasiv provtagningsmetod för hornhinnan med hjälp av ett hornhinneavtrycksmembran (CIM) tillverkat av polytetrafluoretylen. Detta visade sig ha en signifikant högre total isoleringsgrad jämfört med konventionella skrapningsmetoder. Eftersom den är minimalt invasiv erbjuder CIM-provtagningsmetoden en unik möjlighet att ta prov på både den angripna hornhinnan och den opåverkade hornhinnan hos patienter med MK samt ögonen på patienter som inte påverkas av MK. Detta kommer att möjliggöra en mycket bättre förståelse av den kliniska betydelsen av isolerade organismer i MK.

Metagenomiska nästa generations sekvenseringstekniker (NGS) möjliggör genomisk analys av alla mikrober i ett prov, vilket ger en mängd information om närvaron och interaktionen av mikroorganismer samt närvaron eller frånvaron av gener för antimikrobiell resistens (AMR). Tidigare studier som försökte karakterisera den okulära ytans mikrobiom i hälsa med hjälp av metagenomik har visat en mångsidig hemmaostatisk mikrobiom, men har begränsats till pinnprover tagna från locket, bindhinnan och tårar snarare än hornhinnan. Variationer i mikrobiomet har associerats med tillstånd som torra ögonsyndrom, kontaktlinsbruk och infektionssjukdomar, inklusive ett patologiskt mikrobiom som domineras av pseudomonas spp. hos ett litet antal patienter med bakteriell keratit. Trots att hornhinnan är den yta som påverkas av MK, finns det inga data om den friska hornhinnans mikrobiomet eftersom traditionella provtagningsmetoder har varit invasiva.

Trots att NGS genererar personliga resultat på några timmar, är dess känslighet för att upptäcka alla organismer som finns utan att förstå deras kliniska betydelse ett hinder för dess introduktion i klinisk praxis. I detta projekt kommer CIM-provtagningsmetoden och NGS-bearbetning att användas för att förbättra förståelsen av de orsakande organismerna i MK. Vidare, genom provtagning av både de drabbade och opåverkade ögonen hos MK-patienter och från de utan MK, kommer en diagnostisk regel att utvecklas för att identifiera och diskontera kommensala organismer. Inkluderandet av olika kontrollgrupper kommer också att ge information om hur kontaktlinser och ögondroppar påverkar mikrobiomet, vilka har en roll både för utveckling och behandling av MK. Detta kommer avsevärt att underlätta nuvarande tolkning av hornhinneprovsresultat och underlätta potentiell framtida användning av NGS i rutinmässig oftalmisk klinisk praxis.

Syfte och mål

Det övergripande syftet med projektet är att bättre definiera de patogena mikroorganismerna hos patienter med MK genom en bättre förståelse av hornhinnemikrobiomet i hälsa och sjukdom.

Detta kommer att uppnås genom följande mål.

1. Använd NGS, analysera hornhinnemikrobiomet i det drabbade och opåverkade ögat hos patienter med och utan MK och jämför med samtidiga resultat från CDC och MTPCR.
2. Bestäm det mikrobiologiska spektrumet av hornhinnan, ögonytan och sammanhängande strukturer, hos patienter med MK, friska kontroller, kontaktlinsbärare och ögondroppar.

Studera design:

Design: Prospektiv observationsdiagnostisk studie och metod-jämförelse.

Studietid: Tre år.

Antal och typ av ämnen:

151 patienter med MK kommer att rekryteras. Detta är baserat på följande provstorleksberäkning: Nuvarande standard diagnostisk referensmetod (CDM) har en diagnostisk noggrannhet på 40 %. För klinisk implementering av NGS kommer diagnostisk noggrannhet att krävas för att öka till minst 80 %. NGS kan bara öka andelen upptäckta mikroorganismer. För att uppskatta en diagnostisk frekvens på 80 % med ett 95 % konfidensintervall (med bredd 15 %) krävs 137 deltagare. Denna beräkning antar att den minsta diagnosgruppen har en prevalens på 20 %. För att justera för en 10-procentig risk för förlust av uppföljning kommer vi att rekrytera 151 patienter.

Vi kommer också att rekrytera 90 deltagare till fyra kontrollgrupper:

1. 20 patienter utan MK i anamnesen som inte använder ögondroppar
2. 20 patienter utan anamnes på MK som bär kontaktlinser
3. 20 patienter som inte har MK i anamnesen men som är på ögondroppsbehandling för glaukom. Denna grupp har inkluderats för att bedöma förändringar i hornhinnemikrobiomet som kan vara sekundära till droppbehandling.
4. 30 patienter med keratokonus som genomgår tvärbindning kommer att rekryteras. Dessa deltagare som en del av den rutinmässiga tvärbindningsproceduren kommer att få sitt hornhinneepitel borttaget. Detta avlägsnade epitel från en annars frisk hornhinneyta kommer att möjliggöra en direkt jämförelse mellan hornhinnemikrobiomet som karakteriseras från CIM och det som karakteriseras direkt från epitelet.

Insamling av klinisk data

Vid presentationen kommer patientdemografi, riskfaktorer (okulär ytsjukdom, kontaktlinsslitage, tidigare MK) och behandling som erhållits tidigare eller vid presentationen att erhållas från intervju, tillsammans med sårkarakteristika (stora och mindre axlar av hornhinnesåret mätt med en kontinuerlig skala). Ett standardiserat datainsamlingsformulär kommer att användas.

Bästa korrigerade synskärpa (BCVA), storlek, plats och djup av såret kommer att registreras med ett spaltlampabiomikroskop. Sårstorlek (mindre och större axlar) och placering (minsta avstånd från limbus) kommer att mätas. Sårdjupet kommer att mätas på en nominell skala från 1-4 baserat på procentandelen av kvarvarande hornhinnetjocklek under såret.

Provsamling

För varje deltagare kommer följande prover att samlas in:

• Tre CIM från de drabbade och opåverkade ögonen hos deltagare med MK, eller från ett öga hos kontrolldeltagarna.
• Svabbar från bindhinnan i deltagarens drabbade och opåverkade ögon, övre ögonlock och näsa.

Tre CIM kommer att appliceras (PTFE Millipore kulturinlägg, porstorlek 0,40 mikrometer) på hornhinnans yta i 5 sekunder och en CIM på deltagarnas inferior fornix conjunctiva i 5 sekunder med sterila handskar. Ett lokalt bedövningsmedel (en droppe 0,5 % proxymetakain) kommer att instilleras i den nedre konjunktivala fornix innan applicering av CIM. Det första CIM-provet från deltagarnas hornhinna kommer att placeras och transporteras i en flaska innehållande 0,5 ml BHI-buljong för odling. CIM:erna som erhålls från deltagarnas hornhinna och den nedre konjunktiva kommer att hållas torra i ett sterilt rör. Utöver insamlingen av beskrivna prover kommer hornhinneepitelet som tagits bort från patienter som genomgår korneal tvärbindning att placeras i en steril eppendorf och förvaras vid -80 C. Svabbar kommer att tas från deltagarens bindhinna, övre ögonlock och främre navel i ordning att karakterisera det omgivande mikrobiomet och endogena källor.

MK-deltagare uppföljning

Deltagare som presenterar sig med kliniskt misstänkt MK kommer att följas upp 3 dagar, 7 dagar och 1 månad efter presentationen, enligt normal procedur för uppföljning av MK. Vid varje uppföljningsbesök kommer BCVA, storlek och djup på såret att registreras. Alla prover kommer att upprepas vid varje uppföljningsbesök endast från deltagarnas drabbade öga. Dessa kommer att inkludera tre hornhinne-CIMS, konjunktivala, övre ögonlock och näsprov.

Bearbetning av prover och identifiering av mikroorganismer:

1. CDC (etablerad diagnostisk standard): Blod-, choklad- och Sabourauds dextrosagarplattor och en 24-timmars subkultur av BHI-buljongen inokulerad med bakterieproverna och membranen kommer att undersökas för tecken på bakterietillväxt efter 24 och 48 timmars inkubation.
2. MTPCR:DNA kommer att extraheras och kvantifieras från CIM- och virologikonjunktivavpinnen. En multiplex mikroorganismmålinriktad PCR (MTPCR) mastermix, inklusive primers för HSV-1, HSV2, acanthamoeba, 16S och 18S ribosomalt DNA kommer att beredas och PCR utföras med ett realtids PCR-instrument
3. NGS: Metagenomisk testning kommer att utföras med plattformar med hög genomströmning, såsom Illumina HiSeq 4000. Sekvenseringsdjupet kommer att bestämmas empiriskt. Genomanpassningar, filtrering och patogenanrop kommer att utföras med hjälp av etablerade pipelines. En analysmetod baserad på läsklassificering kommer att tillämpas för taxonomisk klassificering. En subtraktiv analysmetod baserad på avlägsnande av värd-DNA och friskt kontrollögonmetagenom kommer att tillämpas.

Statistisk analys:

En jämförelse av isoleringshastigheter och identifierade bakterier erhållna från CDC-, MTPCR- och NGS-bearbetning av MK-hornhinneprover kommer att göras. Detta kommer att visualiseras med hjälp av ett Venn-diagram.

För NGS-data kommer vi att arbeta med Center of Genomic Research (CGR) för att tilldela taxonomietiketter och beräkna relativa mängder i varje prov. För detektering av AMR kommer programvara att användas för att direkt kartlägga läsningar till de i en omfattande AMR-databas och rapportera de närvarande AMR-gener.

Mikroorganismer som identifierats i ögonen med MK kommer sedan att jämföras med kontrollgruppen med ögat och andra kontrollgrupper och subtraktiv bioinformatikmetodik tillämpas för att identifiera de mest sannolika patogena organismerna jämfört med de som ses i den friska hornhinnemikrobiomet.

Jämförelser av den relativa mängden mikroorganismer som erhållits från MK-hornhinnaprover under deltagarnas uppföljningsbesök kommer att användas för att utvärdera longitudinella förändringar i hornhinnemikrobiomet under behandling och upplösning av MK.

En direkt jämförelse mellan den relativa mängden mikroorganismer som isolerats från deltagarnas hornhinna, bindhinna, ögonlock och näsa kommer att göras för att identifiera eventuella endogena infektionskällor för MK. Överlappningar av mikroorganismer mellan provställena kommer att visualiseras med hjälp av ett Venn-diagram och icke-parametriska tester som används för att bedöma skillnader mellan provställena.