미생물 각막염에서 각막의 Microbiome 조사 (STOICA)

미생물 각막염(MK)은 각막 흉터, 천공, 안내염 및 궁극적으로 실명과 같은 시력을 위협하는 합병증을 유발할 수 있는 안과 응급 상황입니다. 환자는 적극적인 국소 항균 요법과 면밀한 치료 반응 모니터링이 필요하며 종종 입원 후 빈번한 외래 방문을 포함합니다.

결과 개선은 원인 미생물을 신속하게 식별하는 데 달려 있습니다. 현재 원인이 될 가능성이 있는 미생물은 기존의 스크래핑 방법과 표준 기존 진단 배양(CDC)을 사용하는 사례의 약 30~40%에서만 분리되며 결과가 임상의에게 제공되기까지 일반적으로 최대 4일이 소요됩니다. 미생물 표적 중합효소 연쇄 반응(MTPCR) 및 메타게놈 분석과 같은 보다 민감한 방법은 미생물을 검출할 가능성을 증가시키지만 공생 미생물을 선택할 가능성을 증가시킬 수 있으므로 치료 임상의가 격리된 유기체 중 어느 것이 가능성이 있는지 해석하기 어렵게 만듭니다. MK에서 원인이 될 수 있습니다.

유기체를 식별하는 데 장벽 중 하나는 각막에서 샘플을 수집하는 데 어려움이 있다는 것입니다. 2015년 리버풀 대학의 Kaye 교수가 이끄는 그룹은 폴리테트라플루오로에틸렌으로 만든 각막 인상막(CIM)을 사용하여 비침습적 각막 샘플링 방법론을 개발했습니다. 이는 기존의 스크레이핑 방법에 비해 전반적으로 상당히 높은 격리율을 갖는 것으로 나타났습니다. 최소 침습적이므로 CIM 샘플링 방법은 MK에 의해 영향을 받지 않은 환자의 눈뿐만 아니라 MK를 나타내는 환자의 영향을 받은 각막과 영향을 받지 않은 각막 모두를 샘플링할 수 있는 고유한 기회를 제공합니다. 이를 통해 MK에서 분리된 유기체의 임상적 중요성을 훨씬 더 잘 이해할 수 있습니다.

Metagenomic 차세대 시퀀싱(NGS) 기술은 시료 내 모든 미생물의 게놈 분석을 가능하게 하여 미생물의 존재 및 상호 작용과 항균 저항(AMR) 유전자의 유무에 관한 풍부한 정보를 제공합니다. metagenomics를 사용하여 건강 상태에서 안구 표면 마이크로바이옴을 특성화하려는 이전 연구에서는 다양한 상주 항상성 마이크로바이옴을 입증했지만 각막이 아닌 뚜껑, 결막 및 눈물에서 채취한 면봉으로 제한되었습니다. 마이크로바이옴의 변이는 안구건조증, 콘택트렌즈 착용 및 슈도모나스 종에 의해 지배되는 병리학적 마이크로바이옴을 포함하는 감염성 병리와 같은 상태와 관련이 있습니다. 세균성 각막염 환자의 소수. 각막이 MK의 영향을 받는 표면임에도 불구하고 전통적인 샘플링 방법이 침습적이었기 때문에 건강한 각막 미생물 군집에 관한 데이터가 없습니다.

NGS는 몇 시간 만에 개인화된 결과를 생성하지만, 임상적 중요성에 대한 이해 없이 존재하는 모든 유기체를 감지하는 민감도는 임상 실습에 도입하는 데 장애가 됩니다. 이 프로젝트에서는 CIM 샘플링 방법과 NGS 처리를 사용하여 MK의 원인균에 대한 이해를 높일 것입니다. 또한 MK 환자와 MK가 없는 환자의 영향을 받은 눈과 영향을 받지 않은 눈을 모두 샘플링하여 공생 유기체를 식별하고 할인하기 위한 진단 규칙을 개발할 것입니다. 다른 통제 그룹을 포함하면 콘택트 렌즈와 안약이 MK의 발달과 치료 모두에 역할을 하는 마이크로바이옴에 미치는 영향에 대한 정보도 제공할 것입니다. 이것은 각막 샘플 결과의 현재 해석을 크게 촉진하고 일상적인 안과 임상 실습에서 NGS의 잠재적인 향후 사용을 촉진할 것입니다.

목표와 목적

이 프로젝트의 전반적인 목표는 건강과 질병의 각막 미생물 군집에 대한 더 나은 이해를 통해 MK 환자의 병원성 미생물을 더 잘 정의하는 것입니다.

이는 다음 목표를 통해 달성될 것입니다.

1. NGS를 사용하여 MK가 있거나 없는 환자의 영향을 받은 눈과 영향을 받지 않은 눈의 각막 미생물을 분석하고 CDC 및 MTPCR의 동시 결과와 비교합니다.
2. MK 환자, 건강한 대조군, 콘택트 렌즈 착용자 및 안약 사용자의 각막, 안구 표면 및 인접 구조의 미생물학적 스펙트럼을 결정합니다.

연구 설계:

설계: 전향적 관찰 진단 연구 및 방법 비교.

연구 기간: 3년.

과목 수 및 유형:

MK 환자 151명을 모집합니다. 이는 다음 샘플 크기 계산을 기반으로 합니다. 현재 표준 진단 참조 방법(CDM)의 진단 정확도는 40%입니다. NGS의 임상 구현을 위해서는 진단 정확도를 최소 80%까지 높여야 합니다. NGS는 검출된 미생물의 비율만 증가시킬 수 있습니다. 95% 신뢰 구간(너비 15%)으로 80%의 진단율을 추정하려면 137명의 참가자가 필요합니다. 이 계산에서는 가장 작은 진단 그룹의 유병률이 20%라고 가정합니다. 후속 조치 실패 가능성의 10% 비율을 조정하기 위해 151명의 환자를 모집합니다.

또한 4개의 통제 그룹에 90명의 참가자를 모집합니다.

1. 안약을 사용하지 않는 MK 병력이 없는 20명의 환자
2. MK 병력이 없는 콘택트렌즈 착용자 20명
3. MK 병력은 없으나 녹내장 점안 치료를 받고 있는 환자 20명. 이 그룹은 점적 치료에 부차적일 수 있는 각막 미생물 군집의 변화를 평가하기 위해 포함되었습니다.
4. 교차 결합을 진행 중인 원추각막 환자 30명을 모집합니다. 일상적인 가교 절차의 일부로 이러한 참가자는 각막 상피를 제거합니다. 그렇지 않으면 건강한 각막 표면에서 제거된 이 상피는 CIM에서 특성화된 각막 미생물 군집과 상피에서 직접 특성화된 각막 미생물군 사이의 직접적인 비교를 허용할 것입니다.

임상 데이터 수집

발표 시 환자의 인구통계, 위험인자(안구 표면 질환, 콘택트렌즈 착용, 이전 MK), 과거에 받았거나 발표 시 사용한 치료 및 궤양 특성(각막 궤양의 주축 및 단축)을 면담을 통해 얻습니다. 연속 척도를 사용하여 측정). 표준화된 데이터 수집 양식이 활용됩니다.

세극등 생체현미경을 사용하여 궤양의 최대 교정 시력(BCVA), 크기, 위치 및 깊이를 기록합니다. 궤양 크기(단축 및 주축) 및 위치(윤부로부터의 최소 거리)를 측정합니다. 궤양 깊이는 궤양 아래 남은 각막 두께의 백분율을 기준으로 1-4의 명목 척도로 측정됩니다.

표본 수집

각 참가자에 대해 다음 샘플이 수집됩니다.

• MK가 있는 참가자의 영향을 받은 눈과 영향을 받지 않은 눈 또는 대조군 참가자의 한쪽 눈에서 나온 3개의 CIM.
• 참가자의 영향을 받은 눈과 영향을 받지 않은 눈, 위쪽 눈꺼풀 및 코의 결막에서 면봉으로 채취합니다.

3개의 CIM(PTFE Millipore 배양 삽입물, 기공 크기 0.40마이크로미터)을 각막 표면에 5초 동안 적용하고 1개의 CIM을 멸균 장갑을 사용하여 5초 동안 참가자의 하원개 결막에 적용합니다. CIM을 적용하기 전에 국소 마취제(0.5% 프록시메타카인 1방울)를 하부 결막원개에 주입합니다. 참가자의 각막에서 채취한 첫 번째 CIM 샘플을 배양용 BHI 브로쓰 0.5mL가 담긴 병에 담아 운반합니다. 참가자의 각막과 하결막에서 얻은 CIM은 멸균 튜브에서 건조한 상태로 유지됩니다. 설명된 샘플 수집에 추가하여, 각막 가교를 겪는 환자로부터 제거된 각막 상피를 멸균 에펜도르프에 넣고 -80C에 보관합니다. 참가자의 결막, 위쪽 눈꺼풀 및 앞쪽 콧구멍에서 순서대로 면봉을 채취합니다. 주변 미생물 및 내인성 소스를 특성화합니다.

MK 참가자 후속 조치

임상적으로 MK가 의심되는 참가자는 MK의 후속 조치를 위한 일반적인 절차에 따라 프레젠테이션 후 3일, 7일 및 1개월에 후속 조치를 받게 됩니다. BCVA 후속 진료 약속 때마다 궤양의 크기와 깊이가 기록됩니다. 모든 샘플은 각 후속 약속에서 영향을 받는 참가자의 눈에서만 반복됩니다. 여기에는 3개의 각막 CIMS, 결막, 위 눈꺼풀 및 비강 면봉이 포함됩니다.

샘플 처리 및 미생물 식별:

1. CDC(확립된 진단 표준): 혈액, 초콜릿 및 Sabouraud's dextrose 한천 플레이트와 박테리아 면봉 및 막으로 접종된 BHI 액체배지의 24시간 계대배양은 24시간 및 48시간 배양 후 박테리아 성장의 증거에 대해 검사됩니다.
2. MTPCR:DNA는 CIM 및 바이러스 결막 면봉에서 추출 및 정량화됩니다. HSV-1, HSV2, 가시아메바, 16S 및 18S 리보솜 DNA에 대한 프라이머를 포함하는 다중 미생물 표적 PCR(MTPCR) 마스터 믹스가 준비되고 실시간 PCR 기기를 사용하여 PCR이 수행됩니다.
3. NGS: Metagenomic 테스트는 Illumina HiSeq 4000과 같은 고처리량 플랫폼을 사용하여 수행됩니다. 시퀀싱 깊이는 경험적으로 결정됩니다. 게놈 정렬, 필터링 및 병원체 호출은 확립된 파이프라인을 사용하여 수행됩니다. 분류학적 분류를 위해 읽기 분류에 기초한 분석 접근법이 적용될 것이다. 숙주 DNA 제거 및 건강한 대조군 눈 메타게놈을 기반으로 한 빼기 분석 방법이 적용됩니다.

통계 분석:

MK 각막 샘플의 CDC, MTPCR 및 NGS 처리에서 얻은 분리율과 확인된 박테리아를 비교합니다. 이것은 Venn Diagram을 사용하여 시각화됩니다.

NGS 데이터의 경우 CGR(Center of Genomic Research)과 협력하여 분류 라벨을 지정하고 각 샘플의 상대적 존재비를 계산합니다. AMR 검출을 위해 소프트웨어를 사용하여 읽기를 포괄적인 AMR 데이터베이스에 직접 매핑하고 존재하는 AMR 유전자를 보고합니다.

그런 다음 MK가 있는 눈에서 식별된 미생물을 대조군 동료 눈 및 기타 대조군과 비교하고 건강한 각막 미생물 군집에서 볼 수 있는 것과 비교하여 가장 가능성이 높은 병원성 유기체를 식별하기 위해 감산 생물 정보학 방법론을 적용합니다.

참여자 후속 방문을 통해 MK 각막 샘플에서 얻은 미생물의 상대적 풍부도를 비교하여 MK의 치료 및 해결 동안 각막 미생물 군집의 세로 변화를 평가하는 데 사용됩니다.

참가자의 각막, 결막, 눈꺼풀 및 코에서 분리된 상대적으로 풍부한 미생물을 직접 비교하여 MK에 대한 가능한 내인성 감염원을 식별할 것입니다. 샘플 사이트 사이의 미생물 중복은 벤 다이어그램과 샘플 사이트 간의 차이점을 평가하는 데 사용되는 비모수 테스트를 사용하여 시각화됩니다.