Undersøgelse af mikrobiomet i hornhinden ved mikrobiel keratitis (STOICA)

Mikrobiel keratitis (MK) er en oftalmologisk nødsituation, der kan føre til synstruende komplikationer såsom ardannelse i hornhinden, perforation, endophthalmitis og i sidste ende blindhed. Patienten har behov for aggressiv topikal antimikrobiel terapi og tæt overvågning af behandlingsrespons, ofte inklusive hospitalsindlæggelse efterfulgt af hyppige ambulante besøg.

Forbedring af resultater afhænger af hurtig identifikation af den forårsagende mikroorganisme. I øjeblikket isoleres den sandsynlige forårsagende mikroorganisme kun i omkring 30 til 40 % af tilfældene ved brug af traditionelle skrabemetoder og standard konventionel diagnostisk kultur (CDC), hvor resultaterne typisk tager op til 4 dage, før de bliver tilgængelige for klinikeren. Mere følsomme metoder såsom mikroorganismemålrettet polymerasekædereaktion (MTPCR) og metagenomisk analyse øger potentialet for at opdage mikroorganismer, men kan øge sandsynligheden for at opfange kommensale mikroorganismer, hvilket gør det vanskeligt for den behandlende kliniker at fortolke, hvilken af ​​de isolerede organismer, der sandsynligvis vil være kausativ i MK.

En af barriererne for at identificere organismerne har været vanskeligheden ved at indsamle prøver fra hornhinden. I 2015 udviklede en gruppe ledet af professor Kaye ved University of Liverpool en ikke-invasiv hornhindeprøvetagningsmetode ved hjælp af en hornhindeaftryksmembran (CIM) fremstillet af polytetrafluorethylen. Dette viste sig at have en signifikant højere samlet isolationsrate sammenlignet med konventionelle skrabemetoder. Da den er minimalt invasiv, giver CIM-prøvetagningsmetoden en unik mulighed for at prøve både den berørte hornhinde og upåvirkede hornhinde hos patienter med MK samt øjnene på patienter, der ikke er påvirket af MK. Dette vil muliggøre en meget bedre forståelse af den kliniske betydning af isolerede organismer i MK.

Metagenomic next-generation sekventeringsteknikker (NGS) muliggør genomisk analyse af alle mikroberne i en prøve, hvilket giver et væld af information om tilstedeværelsen og interaktionen af ​​mikroorganismer samt tilstedeværelsen eller fraværet af antimikrobiel resistens (AMR) gener. Tidligere undersøgelser, der forsøgte at karakterisere det okulære overflademikrobiom i sundhed ved hjælp af metagenomik, har vist et forskelligartet hjemmeostatisk mikrobiom, men det har været begrænset til podninger taget fra låget, bindehinden og tårer i stedet for hornhinden. Variationer i mikrobiomet er blevet forbundet med tilstande som tørre øjne syndrom, kontaktlinsebrug og infektiøse patologier, herunder et patologisk mikrobiom domineret af pseudomonas spp. hos et lille antal patienter med bakteriel keratitis. På trods af at hornhinden er den overflade, der er påvirket af MK, er der ingen data vedrørende det raske hornhindemikrobiom, fordi traditionelle prøveudtagningsmetoder har været invasive.

På trods af at NGS genererer personlige resultater i løbet af få timer, er dens følsomhed til at opdage alle tilstedeværende organismer uden en forståelse af deres kliniske betydning en barriere for dets introduktion i klinisk praksis. I dette projekt vil CIM prøvetagningsmetoden og NGS-behandling blive brugt til at forbedre forståelsen af ​​de forårsagende organismer i MK. Endvidere vil der gennem prøveudtagning af både de berørte og upåvirkede øjne hos MK-patienter og fra dem uden MK blive udviklet en diagnostisk regel til at identificere og udelukke kommensale organismer. Inddragelsen af ​​forskellige kontrolgrupper vil også give information om kontaktlinsers og øjendråbers indflydelse på mikrobiomet, som har en rolle både for udvikling og behandling af MK. Dette vil i høj grad lette den nuværende fortolkning af hornhindeprøveresultater og lette potentiel fremtidig brug af NGS i rutinemæssig oftalmisk klinisk praksis.

Mål og målsætninger

Det overordnede formål med projektet er bedre at definere de patogene mikroorganismer hos patienter med MK gennem en bedre forståelse af hornhindens mikrobiom i sundhed og sygdom.

Dette vil blive opnået gennem følgende mål.

1. Ved hjælp af NGS, analyser hornhindemikrobiomet i det berørte og upåvirkede øje hos patienter med og uden MK og sammenlign med samtidige resultater fra CDC og MTPCR.
2. Bestem det mikrobiologiske spektrum af hornhinden, okulære overflade og sammenhængende strukturer hos patienter med MK, raske kontroller, kontaktlinsebrugere og øjendråberbrugere.

Studere design:

Design: Prospektiv observationel diagnostisk undersøgelse og metode-sammenligning.

Studievarighed: Tre år.

Antal og type af fag:

151 patienter med MK vil blive rekrutteret. Dette er baseret på følgende prøvestørrelsesberegning: Den nuværende standard diagnostiske referencemetode (CDM) har en diagnostisk nøjagtighed på 40 %. For klinisk implementering af NGS kræves det, at diagnostisk nøjagtighed øges til mindst 80 %. NGS kan kun øge andelen af ​​påviste mikroorganismer. For at estimere en diagnostisk rate på 80 % med et 95 % konfidensinterval (med bredde 15 %) kræves 137 deltagere. Denne beregning forudsætter, at den mindste diagnostiske gruppe har en prævalens på 20 %. For at korrigere for en 10%-rate af mulige tab af opfølgning, vil vi rekruttere 151 patienter.

Vi vil også rekruttere 90 deltagere til fire kontrolgrupper:

1. 20 patienter uden MK i anamnesen, som ikke bruger øjendråbemedicin
2. 20 patienter uden MK-historie, som er kontaktlinsebrugere
3. 20 patienter, som ikke har MK i anamnesen, men som er i øjendråbebehandling for glaukom. Denne gruppe er blevet inkluderet for at vurdere ændringer i hornhindens mikrobiom, der kan være sekundære til droppbehandling.
4. 30 patienter med keratoconus, som gennemgår tværbinding, vil blive rekrutteret. Disse deltagere vil som en del af den rutinemæssige tværbindingsprocedure få fjernet deres hornhindeepitel. Dette fjernede epitel fra en ellers sund hornhindeoverflade vil muliggøre en direkte sammenligning mellem hornhindens mikrobiom karakteriseret fra CIM og det karakteriseret direkte fra epitelet.

Klinisk dataindsamling

Ved præsentationen vil patientdemografi, risikofaktorer (okulær overfladesygdom, kontaktlinsebrug, tidligere MK) og behandling modtaget i fortiden eller ved præsentation blive indhentet fra interview, sammen med sårkarakteristika (større og mindre akser af hornhindens ulcus målt ved hjælp af en kontinuerlig skala). Der vil blive anvendt en standardiseret dataindsamlingsformular.

Bedst korrigeret synsstyrke (BCVA), størrelse, placering og dybde af såret vil blive registreret ved hjælp af et spaltelampebiomikroskop. Sårstørrelse (mindre og større akser) og placering (minimumsafstand fra limbus) vil blive målt. Sårdybden vil blive målt på en nominel skala fra 1-4 baseret på procentdelen af ​​den resterende hornhindetykkelse under såret.

Prøvesamling

For hver deltager vil der blive indsamlet følgende prøver:

• Tre CIM'er fra de berørte og upåvirkede øjne hos deltagere med MK, eller fra et øje af kontroldeltagere.
• Podninger fra bindehinden af ​​deltagerens berørte og upåvirkede øjne, øvre øjenlåg og næse.

Tre CIM'er vil blive påført (PTFE Millipore kulturindsats, porestørrelse 0,40 mikrometer) på overfladen af ​​hornhinden i 5 sekunder og en CIM på deltagernes inferior fornix conjunctiva i 5 sekunder med sterile handsker. Et topisk anæstetikum (én dråbe 0,5 % proxymethacain) vil blive inddryppet i den nedre konjunktivale fornix før påføring af CIM'erne. Den første CIM prøve opnået fra deltagernes hornhinde vil blive placeret og transporteret i en flaske indeholdende 0,5 ml BHI bouillon til dyrkning. CIM'erne opnået fra deltagernes hornhinde og den inferior bindehinde vil blive holdt tørre i et sterilt rør. Ud over den beskrevne indsamling af prøver, vil hornhindeepitelet fjernet fra patienter, der gennemgår hornhinde-tværbinding, blive anbragt i en steril eppendorf og opbevaret ved -80 C. Podninger vil blive taget fra deltagerens bindehinde, øvre øjenlåg og forreste næse i rækkefølge. at karakterisere det omgivende mikrobiom og endogene kilder.

MK deltager opfølgning

Deltagere, der præsenterer sig med klinisk mistænkt MK, vil blive fulgt op 3 dage, 7 dage og 1 måned efter præsentationen, i henhold til normal procedure for opfølgning af MK. Ved hver opfølgningssamtale BCVA vil sårets størrelse og dybde blive registreret. Alle prøver vil kun blive gentaget ved hver opfølgningsaftale fra deltagerens berørte øje. Disse vil omfatte tre hornhinde-CIMS, konjunktival, øvre øjenlåg og næsepodninger.

Behandling af prøver og identifikation af mikroorganismer:

1. CDC (etableret diagnostisk standard): Blod-, chokolade- og Sabourauds dextrose-agarplader og en 24-timers subkultur af BHI-bouillonen, der er inokuleret med de bakterielle podninger og membraner, vil blive undersøgt for tegn på bakterievækst efter 24 og 48 timers inkubation.
2. MTPCR:DNA vil blive ekstraheret og kvantificeret fra CIM og virology conjunctival podning. En multipleks mikroorganisme målrettet PCR (MTPCR) master mix, inklusive primere for HSV-1, HSV2, acanthamoeba, 16S og 18S ribosomalt DNA vil blive forberedt, og PCR udføres ved hjælp af et real-time PCR instrument
3. NGS: Metagenomisk testning vil blive udført ved hjælp af high-throughput platforme, såsom Illumina HiSeq 4000. Sekvenseringsdybden vil blive bestemt empirisk. Genomjusteringer, filtrering og patogenkald vil blive udført ved hjælp af etablerede pipelines. En analysemetode baseret på læst klassifikation vil blive anvendt til taksonomisk klassificering. En subtraktiv analysemetode baseret på fjernelse af værts-DNA og sundt kontroløje-metagenom vil blive anvendt.

Statistisk analyse:

En sammenligning af isolationshastigheder og identificerede bakterier opnået fra CDC-, MTPCR- og NGS-behandling af MK-hornhindeprøver vil blive foretaget. Dette vil blive visualiseret ved hjælp af et Venn-diagram.

For NGS-data vil vi arbejde med Center of Genomic Research (CGR) for at tildele taksonomimærker og beregne relative mængder i hver prøve. Til påvisning af AMR vil software blive brugt til direkte at kortlægge læsninger til dem i en omfattende AMR-database og rapportere de tilstedeværende AMR-gener.

Mikroorganismer identificeret i øjnene med MK vil derefter blive sammenlignet med kontrol-med-øjet og andre kontrolgrupper og subtraktiv bioinformatik-metodologi anvendt til at identificere de mest sandsynlige patogene organismer sammenlignet med dem, der ses i det raske hornhindemikrobiom.

Sammenligninger af den relative mængde af mikroorganismer opnået fra MK hornhindeprøver i løbet af deltagernes opfølgningsbesøg vil blive brugt til at evaluere longitudinelle ændringer i hornhindens mikrobiom under behandling og opløsning af MK.

En direkte sammenligning mellem den relative overflod af mikroorganismer isoleret fra deltagernes hornhinde, bindehinde, øjenlåg og næse vil blive foretaget for at identificere eventuelle endogene infektionskilder for MK. Overlapninger af mikroorganismer mellem prøvestederne vil blive visualiseret ved hjælp af et Venn-diagram og ikke-parametriske tests, der bruges til at vurdere forskelle mellem prøvestederne.