Enquête sur le microbiome de la cornée dans la kératite microbienne (STOICA)

La kératite microbienne (MK) est une urgence ophtalmologique qui peut entraîner des complications menaçant la vue telles que des cicatrices cornéennes, une perforation, une endophtalmie et finalement la cécité. Le patient a besoin d'un traitement antimicrobien topique agressif et d'une surveillance étroite de la réponse au traitement, comprenant souvent une hospitalisation suivie de visites fréquentes en ambulatoire.

L'amélioration des résultats dépend de l'identification rapide du micro-organisme responsable. Actuellement, le microorganisme causal probable n'est isolé que dans environ 30 à 40 % des cas à l'aide de méthodes de raclage traditionnelles et d'une culture de diagnostic conventionnelle standard (CDC), les résultats prenant généralement jusqu'à 4 jours pour être mis à la disposition du clinicien. Des méthodes plus sensibles telles que la réaction en chaîne par polymérase ciblée sur les micro-organismes (MTPCR) et l'analyse métagénomique augmentent le potentiel de détection des micro-organismes, mais peuvent augmenter la probabilité de détecter des micro-organismes commensaux, ce qui rend difficile pour le clinicien traitant d'interpréter lequel des organismes isolés est susceptible de être causal dans MK.

L'un des obstacles à l'identification des organismes a été la difficulté de prélever des échantillons de la cornée. En 2015, un groupe dirigé par le professeur Kaye de l'Université de Liverpool a développé une méthodologie d'échantillonnage cornéen non invasive à l'aide d'une membrane d'empreinte cornéenne (CIM) en polytétrafluoroéthylène. Cela s'est avéré avoir un taux d'isolement global significativement plus élevé par rapport aux méthodes de grattage conventionnelles. Comme elle est peu invasive, la méthode d'échantillonnage CIM offre une occasion unique de prélever à la fois la cornée affectée et la cornée non affectée des patients présentant une MK ainsi que les yeux des patients non affectés par la MK. Cela permettra une bien meilleure compréhension de la signification clinique des organismes isolés dans MK.

Les techniques de séquençage métagénomique de nouvelle génération (NGS) permettent l'analyse génomique de tous les microbes d'un échantillon, donnant une mine d'informations sur la présence et l'interaction des micro-organismes ainsi que sur la présence ou l'absence de gènes de résistance aux antimicrobiens (AMR). Des études antérieures tentant de caractériser le microbiome de la surface oculaire en santé à l'aide de la métagénomique ont démontré un microbiome homéostatique résident diversifié, cependant, elles se sont limitées à des écouvillons prélevés sur le couvercle, la conjonctive et les larmes plutôt que sur la cornée. Des variations du microbiome ont été associées à des conditions telles que le syndrome de l'œil sec, le port de lentilles de contact et des pathologies infectieuses, y compris un microbiome pathologique dominé par pseudomonas spp. chez un petit nombre de patients atteints de kératite bactérienne. Bien que la cornée soit la surface affectée par MK, il n'y a pas de données concernant le microbiome cornéen sain car les méthodes d'échantillonnage traditionnelles ont été invasives.

Bien que le NGS génère des résultats personnalisés en quelques heures, sa sensibilité à détecter tous les organismes présents sans comprendre leur signification clinique est un obstacle à son introduction dans la pratique clinique. Dans ce projet, la méthode d'échantillonnage CIM et le traitement NGS seront utilisés pour améliorer la compréhension des organismes responsables de MK. De plus, grâce à l'échantillonnage des yeux affectés et non affectés des patients MK et de ceux sans MK, une règle de diagnostic sera développée pour identifier et écarter les organismes commensaux. L'inclusion de différents groupes de contrôle fournira également des informations sur l'influence des lentilles de contact et des collyres sur le microbiome, qui ont un rôle à la fois sur le développement et le traitement de MK. Cela facilitera grandement l'interprétation actuelle des résultats des échantillons de cornée et facilitera l'utilisation future potentielle du NGS dans la pratique clinique ophtalmique de routine.

Buts et objectifs

L'objectif global du projet est de mieux définir les micro-organismes pathogènes chez les patients atteints de MK grâce à une meilleure compréhension du microbiome cornéen en bonne santé et malade.

Cet objectif sera atteint à travers les objectifs suivants.

1. À l'aide de NGS, analysez le microbiome cornéen de l'œil affecté et non affecté des patients avec et sans MK et comparez avec les résultats simultanés du CDC et du MTPCR.
2. Déterminer le spectre microbiologique de la cornée, de la surface oculaire et des structures contiguës, chez les patients atteints de MK, les témoins sains, les porteurs de lentilles de contact et les utilisateurs de gouttes oculaires.

Étudier le design:

Conception : Étude diagnostique observationnelle prospective et comparaison des méthodes.

Durée de l'étude : Trois ans.

Nombre et type de sujets :

151 patients atteints de MK seront recrutés. Ceci est basé sur le calcul suivant de la taille de l'échantillon : La méthode de référence de diagnostic standard actuelle (CDM) a une précision de diagnostic de 40 %. Pour la mise en œuvre clinique du NGS, la précision du diagnostic devra augmenter à au moins 80 %. Le NGS ne peut qu'augmenter la proportion de micro-organismes détectés. Pour estimer un taux de diagnostic de 80 % avec un intervalle de confiance à 95 % (de largeur 15 %), 137 participants sont nécessaires. Ce calcul suppose que le plus petit groupe de diagnostic a une prévalence de 20 %. Pour tenir compte d'un taux de perte de suivi possible de 10 %, nous allons recruter 151 patients.

Nous recruterons également 90 participants dans quatre groupes de contrôle :

1. 20 patients sans antécédent de MK qui n'utilisent pas de collyre
2. 20 patients sans antécédent de MK porteurs de lentilles de contact
3. 20 patients qui n'ont pas d'antécédents de MK mais qui sont sous traitement par collyre pour un glaucome. Ce groupe a été inclus pour évaluer les changements dans le microbiome cornéen qui pourraient être secondaires au traitement par gouttes.
4. 30 patients atteints de kératocône en cours de cross-linking seront recrutés. Ces participants, dans le cadre de la procédure de réticulation de routine, verront leur épithélium cornéen retiré. Cet épithélium retiré d'une surface cornéenne par ailleurs saine permettra une comparaison directe entre le microbiome cornéen caractérisé à partir du CIM et celui caractérisé directement à partir de l'épithélium.

Collecte de données cliniques

Lors de la présentation, les données démographiques du patient, les facteurs de risque (maladie de la surface oculaire, port de lentilles de contact, MK antérieur) et le traitement reçu dans le passé ou utilisé lors de la présentation seront obtenus à partir d'un entretien, ainsi que les caractéristiques de l'ulcère (axes majeurs et mineurs de l'ulcère cornéen mesurée à l'aide d'une échelle continue). Un formulaire standardisé de collecte de données sera utilisé.

La meilleure acuité visuelle corrigée (MAVC), la taille, l'emplacement et la profondeur de l'ulcère seront enregistrés à l'aide d'un biomicroscope à lampe à fente. La taille de l'ulcère (axes mineurs et majeurs) et son emplacement (distance minimale du limbe) seront mesurés. La profondeur de l'ulcère sera mesurée sur une échelle nominale de 1 à 4 basée sur le pourcentage d'épaisseur cornéenne restante sous l'ulcère.

Collecte de spécimens

Pour chaque participant, les échantillons suivants seront collectés :

• Trois CIM des yeux affectés et non affectés des participants atteints de MK, ou d'un œil des participants témoins.
• Écouvillons de la conjonctive des yeux, des paupières supérieures et du nez affectés et non affectés du participant.

Trois CIM seront appliqués (insert de culture PTFE Millipore, taille des pores 0,40 micromètre) à la surface de la cornée pendant 5 secondes et un CIM sur la conjonctive du fornix inférieur des participants pendant 5 secondes à l'aide de gants stériles. Un anesthésique topique (une goutte de 0,5 % de proxyméthacaïne) sera instillé dans le fornix conjonctival inférieur avant l'application des CIM. Le premier échantillon CIM obtenu à partir de la cornée des participants sera placé et transporté dans une bouteille contenant 0,5 ml de bouillon BHI pour la culture. Les CIM obtenus à partir de la cornée et de la conjonctive inférieure des participants seront conservés au sec dans un tube stérile. En plus de la collecte d'échantillons décrite, l'épithélium cornéen prélevé sur des patients subissant une réticulation cornéenne sera placé dans un eppendorf stérile et stocké à -80 C. Des écouvillons seront prélevés sur la conjonctive, les paupières supérieures et les narines antérieures du participant afin pour caractériser le microbiome environnant et les sources endogènes.

Suivi des participants MK

Les participants présentant une MK cliniquement suspectée seront suivis 3 jours, 7 jours et 1 mois après la présentation, conformément à la procédure normale de suivi de la MK. À chaque rendez-vous de suivi BCVA, la taille et la profondeur de l'ulcère seront enregistrées. Tous les échantillons seront répétés à chaque rendez-vous de suivi à partir de l'œil affecté des participants uniquement. Ceux-ci comprendront trois écouvillons CIMS cornéens, conjonctival, paupière supérieure et nasal.

Traitement des échantillons et identification des micro-organismes :

1. CDC (norme de diagnostic établie) : des plaques de gélose au sang, au chocolat et au dextrose de Sabouraud et une sous-culture de 24 heures du bouillon BHI inoculé avec les écouvillons bactériens et les membranes seront examinées pour rechercher des signes de croissance bactérienne après 24 et 48 h d'incubation.
2. MTPCR : L'ADN sera extrait et quantifié à partir de l'écouvillon conjonctival CIM et virologique. Un mélange maître de PCR multiplex ciblée sur les micro-organismes (MTPCR), comprenant des amorces pour HSV-1, HSV2, acanthamoeba, ADN ribosomique 16S et 18S, sera préparé et PCR effectuée à l'aide d'un instrument de PCR en temps réel
3. NGS : les tests métagénomiques seront effectués à l'aide de plates-formes à haut débit, telles que l'Illumina HiSeq 4000. La profondeur de séquençage sera déterminée empiriquement. Les alignements du génome, le filtrage et l'appel des agents pathogènes seront effectués à l'aide de pipelines établis. Une approche d'analyse basée sur la classification des lectures sera appliquée pour la classification taxonomique. Une méthode d'analyse soustractive basée sur l'élimination de l'ADN de l'hôte et du métagénome de l'œil témoin sain sera appliquée.

Analyses statistiques:

Une comparaison des taux d'isolement et des bactéries identifiées obtenues à partir du traitement CDC, MTPCR et NGS d'échantillons de cornée MK sera effectuée. Cela sera visualisé à l'aide d'un diagramme de Venn.

Pour les données NGS, nous travaillerons avec le Centre de recherche génomique (CGR) pour attribuer des étiquettes de taxonomie et calculer les abondances relatives dans chaque échantillon. Pour la détection de la RAM, un logiciel sera utilisé pour mapper directement les lectures à celles d'une base de données complète sur la RAM et signaler les gènes de la RAM présents.

Les micro-organismes identifiés dans les yeux avec MK seront ensuite comparés à l'autre œil témoin et à d'autres groupes témoins et une méthodologie bioinformatique soustractive appliquée pour identifier les organismes pathogènes les plus probables par rapport à ceux observés dans le microbiome cornéen sain.

Les comparaisons de l'abondance relative des micro-organismes obtenus à partir d'échantillons de cornée MK au cours des visites de suivi des participants seront utilisées pour évaluer les changements longitudinaux du microbiome cornéen pendant le traitement et la résolution de MK.

Une comparaison directe entre l'abondance relative des micro-organismes isolés de la cornée, de la conjonctive, des paupières et du nez des participants sera effectuée afin d'identifier toutes les sources endogènes possibles d'infection pour MK. Les chevauchements de micro-organismes entre les sites d'échantillonnage seront visualisés à l'aide d'un diagramme de Venn et de tests non paramétriques utilisés pour évaluer les différences entre les sites d'échantillonnage.