A szaruhártya mikrobiomának vizsgálata mikrobiális keratitisben (STOICA)

A mikrobiális keratitis (MK) egy szemészeti vészhelyzet, amely látást veszélyeztető szövődményekhez, például szaruhártya hegesedéséhez, perforációhoz, endoftalmitishez és végső soron vaksághoz vezethet. A betegnek agresszív helyi antimikrobiális terápiára és a kezelésre adott válasz szoros monitorozására van szüksége, gyakran kórházi kezelésre, majd gyakori ambuláns látogatásokra.

Az eredmények javulása a kiváltó mikroorganizmus gyors azonosításán múlik. Jelenleg a valószínű kórokozó mikroorganizmust csak az esetek 30-40%-ában izolálják hagyományos kaparási módszerekkel és standard hagyományos diagnosztikai tenyészettel (CDC), és az eredmények jellemzően 4 napig tartanak, amíg a klinikus rendelkezésére állnak. Az érzékenyebb módszerek, mint például a mikroorganizmusok célzott polimeráz láncreakciója (MTPCR) és a metagenomikus analízis növelik a mikroorganizmusok kimutatásának lehetőségét, de növelhetik a kommenzális mikroorganizmusok felszedésének valószínűségét, megnehezítve a kezelő klinikus számára annak értelmezését, hogy az izolált szervezetek közül melyik valószínűsíthető MK-ban legyen okozó.

Az élőlények azonosításának egyik akadálya a szaruhártya mintavételének nehézsége. 2015-ben a Liverpooli Egyetem Kaye professzor által vezetett csoportja non-invazív szaruhártya-mintavételi módszert fejlesztett ki politetrafluor-etilénből készült szaruhártya lenyomatmembrán (CIM) felhasználásával. Kimutatták, hogy ez szignifikánsan magasabb általános izolációs rátával rendelkezik a hagyományos kaparási módszerekhez képest. Mivel minimálisan invazív, a CIM mintavételi módszer egyedülálló lehetőséget kínál mind az MK-ban szenvedő betegek érintett szaruhártyájából, mind a nem érintett szaruhártya, valamint az MK-ban nem érintett betegek szeméből. Ez lehetővé teszi az izolált organizmusok klinikai jelentőségének sokkal jobb megértését MK-ban.

A metagenomikus következő generációs szekvenálási (NGS) technikák lehetővé teszik a mintában lévő összes mikroba genomiális elemzését, és rengeteg információt adnak a mikroorganizmusok jelenlétéről és kölcsönhatásairól, valamint az antimikrobiális rezisztencia (AMR) gének jelenlétéről vagy hiányáról. Azok a korábbi tanulmányok, amelyek a szem felszíni mikrobiómát az egészségben metagenomika segítségével próbálták jellemezni, változatos, rezidens homeosztatikus mikrobiomot mutattak ki, azonban a fedélről, a kötőhártyáról és a könnyekből vett tamponokra korlátozódtak, nem pedig a szaruhártyáról. A mikrobióm változásait olyan állapotokkal hozták összefüggésbe, mint a száraz szem szindróma, a kontaktlencse viselése és a fertőző patológiák, beleértve a pseudomonas spp. által dominált patológiás mikrobiomot. kevés bakteriális keratitisben szenvedő betegnél. Annak ellenére, hogy a szaruhártya az MK által érintett felület, nincs adat a szaruhártya egészséges mikrobiómáról, mivel a hagyományos mintavételi módszerek invazívak.

Annak ellenére, hogy az NGS néhány óra alatt személyre szabott eredményeket generál, érzékenysége az összes jelenlévő organizmus kimutatására anélkül, hogy megértené azok klinikai jelentőségét, akadályozza a klinikai gyakorlatba való bevezetését. Ebben a projektben a CIM mintavételi módszert és az NGS-feldolgozást használják az MK-ban előforduló kórokozók jobb megértésére. Továbbá, mind az MK-betegek érintett és nem érintett szeméből, mind az MK-ban nem szenvedőkből mintavételezéssel diagnosztikai szabályt dolgoznak ki a kommenzális organizmusok azonosítására és diszkontálására. A különböző kontrollcsoportok bevonása a kontaktlencsék és a szemcseppek mikrobiómra gyakorolt ​​hatásáról is tájékoztatást ad, amelyek mind az MK kialakulásában, mind kezelésében szerepet játszanak. Ez nagyban megkönnyíti a szaruhártya minta eredményeinek jelenlegi értelmezését, és megkönnyíti az NGS esetleges jövőbeni felhasználását a rutin szemészeti klinikai gyakorlatban.

Célok és célkitűzések

A projekt általános célja az MK-ban szenvedő betegek patogén mikroorganizmusainak pontosabb meghatározása a szaruhártya mikrobiómának jobb megértése révén az egészség és a betegségek területén.

Ez a következő célok révén valósul meg.

1. NGS segítségével elemezze a szaruhártya mikrobiomát az MK-ban szenvedő és nem fertőzött betegek érintett és nem érintett szemében, és hasonlítsa össze a CDC és MTPCR egyidejű eredményeivel.
2. Határozza meg a szaruhártya, a szemfelszín és a szomszédos struktúrák mikrobiológiai spektrumát MK-ban szenvedő betegeknél, egészséges kontrolloknál, kontaktlencsét viselőknél és szemcseppeket használóknál.

Dizájnt tanulni:

Tervezés: Prospektív megfigyeléses diagnosztikai vizsgálat és módszerek-összehasonlítás.

Tanulmányi idő: három év.

A tantárgyak száma és típusa:

151 MK-s beteget vesznek fel. Ez a következő mintaméret-számításon alapul: A jelenlegi standard diagnosztikai referenciamódszer (CDM) diagnosztikai pontossága 40%. Az NGS klinikai megvalósításához a diagnosztikai pontosságot legalább 80%-ra kell növelni. Az NGS csak növelheti a kimutatott mikroorganizmusok arányát. A 80%-os diagnosztikai arány 95%-os konfidenciaintervallum melletti (15%-os szélességű) becsléséhez 137 résztvevőre van szükség. Ez a számítás azt feltételezi, hogy a legkisebb diagnosztikai csoport prevalenciája 20%. A nyomon követés lehetséges elvesztésének 10%-os arányának kiigazítása érdekében 151 beteget veszünk fel.

90 résztvevőt is toborozunk négy kontrollcsoportba:

1. 20 olyan beteg, akiknek a kórelőzményében nem szerepelt MK, akik nem használnak szemcsepp gyógyszert
2. 20 kontaktlencsét viselő beteg, akiknek a kórtörténetében nem szerepelt MK
3. 20 olyan beteg, akiknek a kórelőzményében nem szerepel MK, de glaukóma miatt szemcsepp-kezelésben részesülnek. Ezt a csoportot azért vették fel, hogy felmérjék a szaruhártya mikrobiomában bekövetkezett változásokat, amelyek másodlagosak lehetnek a cseppkezelés miatt.
4. 30 keratoconusos beteget vesznek fel, akik keresztkötéseken esnek át. Ezeknek a résztvevőknek a rutin keresztkötési eljárás részeként eltávolítják a szaruhártya epitéliumát. Ez az egyébként egészséges szaruhártya felületről eltávolított hám lehetővé teszi a CIM-ből és a közvetlenül a hámból jellemzett szaruhártya mikrobiom közvetlen összehasonlítását.

Klinikai adatgyűjtés

A bemutatáskor a páciens demográfiai adatait, kockázati tényezőit (szemfelszíni betegség, kontaktlencse-viselés, korábbi MK), a múltban kapott vagy a bemutatáskor alkalmazott kezelést, valamint a fekély jellemzőit (a szaruhártyafekély fő- és melléktengelyei) kapjuk meg. folytonos skála segítségével mérve). Egy szabványos adatgyűjtési űrlap kerül felhasználásra.

A legjobb korrigált látásélességet (BCVA), a fekély méretét, helyét és mélységét réslámpás biomikroszkóp segítségével rögzítjük. Meg kell mérni a fekély méretét (kis- és főtengely) és elhelyezkedését (minimális távolság a limbustól). A fekély mélységét 1-4 névleges skálán mérik, a szaruhártya fekély alatti maradék vastagságának százalékos aránya alapján.

Mintagyűjtemény

Minden résztvevő esetében a következő mintákat gyűjtik:

• Három CIM az MK-ban szenvedő résztvevők érintett és nem érintett szeméből, vagy a kontroll résztvevők egyik szeméből.
• Tamponok a résztvevő érintett és nem érintett szemének, felső szemhéjának és orrának kötőhártyájáról.

Három CIM-et (PTFE Millipore kultúra betét, pórusméret 0,40 mikrométer) alkalmaznak a szaruhártya felületére 5 másodpercre, és egy CIM-et a résztvevők inferior fornix conjunctivára 5 másodpercig steril kesztyűben. A CIM-ek alkalmazása előtt helyi érzéstelenítőt (egy csepp 0,5%-os proximetakaint) csepegtetünk az alsó kötőhártya-fornixba. A résztvevők szaruhártyájától kapott első CIM-mintát egy 0,5 ml BHI táptalajt tartalmazó palackba helyezik és szállítják a tenyésztéshez. A résztvevők szaruhártyájától és az inferior kötőhártyától kapott CIM-eket steril csőben szárazon tartják. A leírt mintagyűjtésen túlmenően a szaruhártya térhálósodáson átesett betegekről eltávolított szaruhártya-hámot steril eppendorfba helyezzük és -80 C-on tároljuk. A résztvevő kötőhártyájáról, felső szemhéjáról és elülső orráról mintavételezésre kerül sor. a környező mikrobiom és az endogén források jellemzésére.

MK résztvevő nyomon követése

A klinikailag gyanított MK-val jelentkező résztvevőket a bemutatást követő 3., 7. napon és 1. hónapban követik nyomon, az MK követésének szokásos eljárása szerint. Minden egyes BCVA nyomon követési időpontban rögzítik a fekély méretét és mélységét. Az összes mintát megismétlik minden egyes utóellenőrzési időpontban, csak a résztvevők érintett szemétől. Ezek közé tartozik három szaruhártya CIMS, kötőhártya, felső szemhéj és orrtampon.

A minták feldolgozása és a mikroorganizmusok azonosítása:

1. CDC (megállapított diagnosztikai standard): Vér-, csokoládé- és Sabouraud-féle dextróz agarlemezeket, valamint a BHI-leves 24 órás szubkultúráját, amelyet a bakteriális tamponokkal és membránokkal oltottak be, megvizsgálják a baktériumok szaporodásának bizonyítékaként 24 és 48 órás inkubáció után.
2. Az MTPCR:DNS-t kivonják és mennyiségileg meghatározzák a CIM és virológiai kötőhártya-tamponból. Multiplex mikroorganizmus célzott PCR (MTPCR) mesterkeveréket készítenek, amely tartalmazza a HSV-1, HSV2, acanthamoeba, 16S és 18S riboszomális DNS primereket, és a PCR-t valós idejű PCR eszközzel hajtják végre.
3. NGS: A metagenomikus tesztelést nagy áteresztőképességű platformokon, például az Illumina HiSeq 4000-en hajtják végre. A szekvenálás mélységét empirikusan határozzuk meg. A genom-igazítás, a szűrés és a kórokozók lehívása kialakított csővezetékek segítségével történik. A taxonómiai osztályozáshoz olvasott osztályozáson alapuló elemzési megközelítést alkalmazunk. A gazda-DNS és az egészséges kontroll szem metagenom eltávolításán alapuló kivonó elemzési módszert alkalmazunk.

Statisztikai analízis:

Összehasonlítják az izolálási arányokat és az MK szaruhártya-minták CDC-, MTPCR- és NGS-feldolgozásából nyert azonosított baktériumokat. Ezt egy Venn-diagram segítségével lehet megjeleníteni.

Az NGS-adatok esetében a Genomikus Kutatási Központtal (CGR) együttműködve taxonómiai címkéket rendelünk hozzá, és kiszámítjuk a relatív abundanciákat az egyes mintákban. Az AMR kimutatására szoftvert használnak, hogy közvetlenül leképezzék a leolvasásokat egy átfogó AMR-adatbázisban, és jelentsék a jelenlévő AMR-géneket.

A szemben az MK-val azonosított mikroorganizmusokat ezután összehasonlítják a kontrolltárs szemmel és más kontrollcsoportokkal, és szubtraktív bioinformatikai módszertant alkalmaznak a legvalószínűbb patogén organizmusok azonosítására, összehasonlítva az egészséges szaruhártya mikrobiomában észlelt mikroorganizmusokkal.

A szaruhártya MK-mintáiból nyert mikroorganizmusok relatív abundanciájának összehasonlítása a résztvevő utánkövetési vizitek során a szaruhártya mikrobiomának longitudinális változásainak értékelésére szolgál a kezelés és az MK feloldása során.

A résztvevők szaruhártyájából, kötőhártyájából, szemhéjából és orrából izolált mikroorganizmusok relatív mennyiségének közvetlen összehasonlítása az MK lehetséges endogén fertőzési forrásainak azonosítása érdekében történik. A mikroorganizmusok átfedéseit a mintahelyek között egy Venn-diagram és a mintahelyek közötti különbségek értékelésére használt nem-paraméteres tesztek segítségével lehet megjeleníteni.