心臓線維症に対するインターバルトレーニングの効果

2009 年 1 月 1 日から 2018 年 12 月 31 日まで、4 週間以上臨床状態が安定している心臓病患者は、36 回の HIIT を完了しました。 HIITの前後に臨床評価（以下に記載）を受けた被験者が含まれます。

*年齢、性別、体格指数、疾患期間、併存疾患、投薬歴などのベースライン情報がレビューされました。 -心エコー検査、生活の質に関する簡易フォーム36健康調査（SF-36）、段階的心肺運動検査（CPET）、後期ガドリニウム増強を伴う心臓磁気共鳴画像法（CMR-LGE）、血液化学検査（ヘマトクリット、脳ナトリウム利尿ペプチド、高感度 C 反応性タンパク質、クレアチニン)、および HIIT 前後の保存血清*。

細胞の挙動 ヒト成体心室から分離されたヒト心臓線維芽細胞 (CF) (HCF-av 細胞、ScienCell Research Laboratories、カールズバッド、カリフォルニア州、米国) は、10 % FBS、1 % 線維芽細胞増殖サプリメント、および 1 % ペニシリン/ストレプトマイシンを含む培地で培養されます。 . 細胞 (1x10^5) を直径 10 cm のディッシュに播種し、上記の培地で一晩培養しました。 10% ウシ胎児血清 (FBS) の代わりに患者血清の 10% を使用して、ヒト成体心室から分離されたヒト心臓線維芽細胞 (CF) (HCF-av 細胞、ScienCell Research Laboratories、カリフォルニア州カールスバッド) を処理しました。 CFに対する血清効果を評価した。

細胞培養 ヒト成体心室から分離されたヒト心臓線維芽細胞 (CF) (HCF-av 細胞、ScienCell Research Laboratories、カリフォルニア州カールスバッド、米国) は、10 % FBS、1 % 線維芽細胞増殖サプリメント、および 1 % ペニシリン/ストレプトマイシンを含む培地で培養されました。 . 細胞 (1x10^5) を直径 10 cm のディッシュに播種し、上記の培地で一晩培養しました。

細胞遊走アッセイ HIIT前後の心臓病患者から得られた血清中の細胞遊走速度は、前述のように決定されました。 簡単に言えば、3000 個の HCF-av 細胞を、ポリアクリルアミド基質を含む各 3.5 cm ペトリ皿に播種し、HIIT の前後に 10% の心臓患者血清を含む培地で収穫しました。 位相コントラスト画像は、20X、開口数0.75のアクロマートを備えたEclipse Ti-E倒立顕微鏡システム（Nikon Instruments Inc.、Melville、NY）に取り付けられた冷却電荷結合素子カメラ（Photometrics、Tucson、AZ）を使用して記録されました。位相対物レンズと INU シリーズ ステージ トップ インキュベーター (株式会社東海 HIT、静岡県、日本)。 細胞の位置は、核の中心に基づいて、120〜180分間、10分ごとに決定されました。 パーシステント ランダム ウォーク方程式に基づいて移動速度を計算しました。

細胞増殖アッセイ 7.5x10^3 の HCF-av 細胞を、48 ウェル細胞培養プレート (Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス) の各ウェル (0.95 cm^2 増殖面積) に、通常の培地で 8 時間プレーティングしました。 . その後、1.5% FBSを含む飢餓培地で一晩培養した。 調製した細胞を Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific Inc.、マサチューセッツ州ウォルサム) で 15 分間染色した後、リン酸緩衝生理食塩水で 2 回洗浄しました。 それらは、10% FBS (10 ウェル) と、HIIT の前 (24 ウェル) および HIIT 後 (24 ウェル) に被験者から得られた 10% 患者血清で別々に処理されました。 IN Cell Analyzer 1000 細胞イメージングおよび分析システム (GE Healthcare Bio-Science Corp.、ニュージャージー州ピスカタウェイ) を使用して、3 つの異なる培養培地で採取してから 0、24 時間、および 48 時間後に細胞数をカウントしました。

プロテオミクス分析 異なる治療グループのタンパク質濃度は、ビシンコニン酸アッセイ（ThermoFisher Scientific Inc.）によって決定されました。 タンパク質混合物を、12.5% SDS-PAGEゲルでの電気泳動と、それに続く以下の手順によるゲル内酵素消化によって分離した。 95 oC で 5 分間熱変性させた後、ジチオスレイトール (DTT) を添加して最終濃度 10 mM までタンパク質サンプルを還元し、50 oC で 30 分間インキュベートしました。 暗所で室温で３０分間インキュベーションする前に、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を２０ｍＭの最終濃度まで添加することによってアルキル化を行った。 次に、DTT の 2 番目のアリコートを加えて、未反応の IAA をクエンチしました。 トリプシン消化のために、トリプシンを添加し (1:50、w/w)、反応混合物を 37 oC で 12 時間インキュベートしました。 トリプシン消化は、10 microL ギ酸 (10%) の添加によってクエンチされました。 消化されたペプチドは、質量分析のためにスピードバックによって乾燥されました。

トリプシンペプチドは、ナノエレクトロスプレーイオン源（New Objective、Inc. 、マサチューセッツ州ウォーバーン) ポジティブ イオン モードで。 液体クロマトグラフィーシステムは、Ｆａｍｏｓオートサンプラー（ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州パロアルト）であった。 ペプチド溶液を自己充填プレカラム (150 microm I.D. x 20 mm、5 microm、200 Å) に注入し、自己充填逆相 C18 ナノカラム (75 microm I.D. x 300 mm、 5 microm、100 Å) 水 (移動相 A) で 0.1% のギ酸と 80% アセトニ トリル (移動相 B) で 0.1% のギ酸を使用して。 300 nL/分の流速で 40 分間、5 ～ 40% の移動相 B の直線勾配を適用しました。 エレクトロスプレー電圧は 2.0 kV で印加し、キャピラリー温度は 200 oC に設定しました。 スキャン サイクルは、400 Da で 100,000 の分解能を持つ FT-ICR 質量分析計で実行されるフルスキャン サーベイ MS スペクトル (m/z 300 ～ 2000) で開始されました。 このスキャンで検出された 10 個の最も豊富なイオンを、リニア四重極イオン トラップ (LTQ) 質量分析計で実行される MS/MS 実験にかけました。 フルスキャンおよび MS/MS のイオン蓄積 (Auto Gain Control ターゲット数) および最大イオン蓄積時間は、1 x 106 イオン、1000 ms および 5 x 104 イオン、200 ms に設定されました。 正規化衝突エネルギーを 35 % に設定し、活性化 Q を 0.3、活性化時間を 30 ms として、CID (衝突誘起解離) を使用してイオンをフラグメント化しました。

すべての実験 RAW ファイルは、ラベルフリーのタンパク質定量のために MaxQuant (1.5.3.30) にかけられました。 MaxQuant の検索パラメーターの可変翻訳後修飾は、メチオニンの酸化、およびセリン/スレオニン/チロシンのリン酸化を含むように割り当てられました。システインのカルバミドメチル化は、固定修飾として割り当てられました。 消化のための酵素は、ミス切断番号 2 のトリプシンに割り当てられました。 MS/MS 検索には、SwissProt 2018_06 のホモ サピエンス タンパク質配列を使用しました。 タンパク質の定量結果は、MaxQuant からの LFQ 強度によって得られました。

統計分析 Wilcoxon マッチドペアの符号付き順位検定を使用して、各個人の HIIT 前後の運動能力パラメーター、CMR-LGE 結果、血液化学データ、および SF-36 スコアを比較しました。 スチューデント t 検定を使用して、HIIT 前後のタンパク質レベルの変化を評価しました。