Effetti degli effetti dell'interval training sulla fibrosi cardiaca

Dal 1 gennaio 2009 al 31 dicembre 2018, i pazienti cardiopatici con stato clinico stabile per più di 4 settimane hanno completato 36 volte di HIIT. Saranno inclusi soggetti con valutazioni cliniche (elencate di seguito) prima e dopo HIIT.

*Sono state esaminate le informazioni di riferimento, tra cui età, sesso, indice di massa corporea, durata della malattia, comorbilità e anamnesi farmacologica. Soggetti con esame ecocardiografico, short form-36 health survey (SF-36) for quality of life, test da sforzo cardiopolmonare graduato (CPET), risonanza magnetica cardiaca con potenziamento tardivo del gadolinio (CMR-LGE), esami ematochimici (ematocrito, peptide natriuretico, proteina C-reattiva ad alta sensibilità, creatinina) e sieri conservati prima e dopo HIIT.*

Comportamenti cellulari I fibroblasti cardiaci umani (CF) isolati dal ventricolo umano adulto (cellule HCF-av, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA) sono coltivati ​​in terreno contenente il 10% di FBS, l'1% di supplemento per la crescita dei fibroblasti e l'1% di penicillina/streptomicina . Le cellule (1x10^5) sono state seminate in piatti di 10 cm di diametro e sono state coltivate nel suddetto terreno durante la notte. Abbiamo usato il 10% del siero del paziente in sostituzione del 10% di siero bovino fetale (FBS) per trattare il fibroblasto cardiaco umano (CF) isolato dal ventricolo umano adulto (cellula HCF-av, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA), e sono stati valutati gli effetti del siero sulla FC.

Coltura cellulare I fibroblasti cardiaci umani (CF) isolati dal ventricolo umano adulto (cellule HCF-av, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA) sono stati coltivati ​​in un terreno contenente il 10% di FBS, l'1% di supplemento per la crescita dei fibroblasti e l'1% di penicillina/streptomicina . Le cellule (1x10^5) sono state seminate in piatti di 10 cm di diametro e sono state coltivate nel suddetto terreno durante la notte.

Saggio di migrazione cellulare La velocità di migrazione cellulare nel siero ottenuto da pazienti cardiopatici prima e dopo l'HIIT è stata determinata come descritto in precedenza. In breve, cellule HCF-av di 3000 sono state placcate su ciascuna piastra Petri da 3,5 cm con substrati di poliacrilammide e sono state raccolte in terreni contenenti il ​​10% di sieri di pazienti cardiopatici prima e dopo HIIT. Le immagini a contrasto di fase sono state registrate utilizzando una fotocamera con dispositivo ad accoppiamento di carica raffreddato (Photometrics, Tucson, AZ), collegata a un sistema di microscopio invertito Eclipse Ti-E (Nikon Instruments Inc., Melville, NY) dotato di un 20X, apertura numerica 0,75 Achromat lente dell'obiettivo di fase e un incubatore da palco della serie INU (Tokai HIT Co., Ltd., Shizuoka-ken, Giappone). La posizione della cella è stata determinata ogni 10 minuti per un periodo di 120-180 minuti, in base al centro del nucleo. La velocità di migrazione è stata calcolata in base all'equazione del cammino casuale persistente.

Saggio di proliferazione cellulare Cellule HCF-av di 7,5x10^3 sono state piastrate in ciascun pozzetto (area di crescita di 0,95 cm^2) di una piastra di coltura cellulare a 48 pozzetti (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) con terreno ordinario per 8 ore . Sono stati quindi coltivati ​​​​in un mezzo di fame contenente l'1,5% di FBS durante la notte. Le cellule preparate sono state colorate con Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) per 15 minuti e sono state quindi lavate due volte in soluzione salina tamponata con fosfato. Sono stati trattati separatamente con il 10% di FBS (10 pozzetti) e il 10% di siero del paziente ottenuto dai nostri soggetti prima (24 pozzetti) e dopo HIIT (24 pozzetti). Abbiamo utilizzato il sistema di imaging e analisi cellulare IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ) per contare i numeri di cellule a 0, 24 ore e 48 ore dopo la raccolta con i tre diversi terreni di coltura.

Analisi proteomica Le concentrazioni proteiche di diversi gruppi di trattamento sono state determinate mediante analisi dell'acido bicinconinico (ThermoFisher Scientific Inc.). Le miscele proteiche sono state separate mediante elettroforesi su gel SDS-PAGE al 12,5%, seguita da digestione enzimatica in gel secondo la seguente procedura. Dopo la denaturazione termica a 95°C per 5 minuti, i campioni proteici sono stati ridotti mediante l'aggiunta di ditiotreitolo (DTT) a una concentrazione finale di 10 mM e incubati a 50°C per 30 minuti. L'alchilazione è stata eseguita aggiungendo iodoacetammide (IAA) a una concentrazione finale di 20 mM prima dell'incubazione a temperatura ambiente per 30 minuti al buio. Una seconda aliquota di DTT è stata quindi aggiunta per estinguere l'IAA non reagito. Per la digestione con tripsina, è stata aggiunta tripsina (1:50, p/p) e la miscela di reazione è stata incubata a 37°C per 12 ore. La digestione della tripsina è stata spenta mediante l'aggiunta di un acido formico da 10 microL (10%). I peptidi digeriti sono stati essiccati mediante speedvac per l'analisi di massa.

I peptidi triptici sono stati analizzati su uno spettrometro di massa ibrido LTQ-FT (trappola ionica quadrupolare lineare-risonanza ciclotronica ionica trasformata di Fourier) (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) dotato di una sorgente di ioni nano-elettrospray (New Objective, Inc. ., Woburn, MA) in modalità ioni positivi. Il sistema di cromatografia liquida era l'HPLC Agilent serie 1100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) con l'autocampionatore Famos (LC Packings, San Francisco, CA). La soluzione peptidica è stata iniettata su una precolonna auto-impaccata (150 microm I.D. x 20 mm, 5 microm, 200 Å) e la separazione cromatografica è stata eseguita in sequenza su una nano-colonna C18 a fase inversa auto-impaccata (75 microm I.D. x 300 mm, 5 microm, 100 Å) utilizzando acido formico allo 0,1% in acqua (fase mobile A) e acido formico allo 0,1% in acetonitrile all'80% (fase mobile B). È stato applicato un gradiente lineare dal 5 al 40% della fase mobile B per 40 min a una portata di 300 nL/min. La tensione dell'elettrospray è stata applicata a 2,0 kV e la temperatura capillare è stata impostata a 200 oC. È stato avviato un ciclo di scansione con uno spettro MS di rilevamento a scansione completa (m/z 300 - 2000) eseguito sullo spettrometro di massa FT-ICR con risoluzione di 100.000 a 400 Da. Dieci ioni più abbondanti rilevati in questa scansione sono stati sottoposti a un esperimento MS/MS eseguito nello spettrometro di massa a trappola ionica a quadrupolo lineare (LTQ). L'accumulo di ioni (numero target di controllo del guadagno automatico) e il tempo massimo di accumulo di ioni per scansione completa e MS/MS sono stati impostati a 1 x 106 ioni, 1000 ms e 5 x 104 ioni, 200 ms. Gli ioni sono stati frammentati mediante l'uso di CID (dissociazione indotta da collisione) con l'energia di collisione normalizzata impostata al 35%, Q di attivazione pari a 0,3 e tempo di attivazione pari a 30 ms.

Tutti i file RAW dell'esperimento sono stati sottoposti a MaxQuant (1.5.3.30) per la quantificazione delle proteine ​​​​senza etichetta. Le modifiche post-traduzionali variabili dei parametri di ricerca in MaxQuant sono state assegnate per includere l'ossidazione della metionina e la fosforilazione di serina/treonina/tirosina. La carbamidometilazione della cisteina è stata assegnata come modifica fissa. L'enzima per la digestione è stato assegnato alla tripsina con la mancata scissione numero due. Le sequenze proteiche Homo Sapiens di SwissProt 2018_06 sono state utilizzate per la ricerca MS/MS. I risultati della quantificazione delle proteine ​​sono stati ottenuti dall'intensità LFQ da MaxQuant.

Analisi statistica Il test dei ranghi firmati delle coppie abbinate di Wilcoxon è stato utilizzato per confrontare i parametri della capacità di esercizio, i risultati CMR-LGE, i dati ematochimici e i punteggi SF-36 prima e dopo l'HIIT in ciascun individuo. Il test t di Student è stato utilizzato per valutare i cambiamenti del livello proteico prima e dopo l'HIIT.