Effekter af intervaltræningseffekter på hjertefibrose

Fra 1. januar 2009 til 31. december 2018 har hjertepatienter med stabil klinisk status i mere end 4 uger gennemført 36 gange HIIT. Emner med kliniske vurderinger (angivet nedenfor) før og efter HIIT vil blive inkluderet.

*Basislinjeoplysninger, herunder alder, køn, kropsmasseindeks, sygdomsvarighed, komorbiditeter og medicinhistorie blev gennemgået. Forsøgspersoner med ekkokardiografisk undersøgelse, kort form-36 helbredsundersøgelse (SF-36) for livskvaliteter, graderet kardiopulmonal træningstest (CPET), hjertemagnetisk resonansbilleddannelse med sen gadoliniumforstærkning (CMR-LGE), blodkemiske test (hæmatokrit, hjerne) natriuretisk peptid, højfølsomt C-reaktivt protein, kreatinin) og konserverede sera før og efter HIIT.*

Celleadfærd Human cardiac fibroblast (CF) isoleret fra human voksen ventrikel (HCF-av celle, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA) dyrkes i medium indeholdende 10 % FBS, 1 % fibroblast væksttilskud og 1 % penicillin/streptomycin . Celler (1x10^5) blev podet i skåle med 10 cm diameter og blev dyrket i ovennævnte medium natten over. Vi brugte 10 % af patientserumet som erstatning for 10 % føtalt bovint serum (FBS) til behandling af human cardiac fibroblast (CF) isoleret fra human voksen ventrikel (HCF-av celle, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA), og serumeffekter på CF blev evalueret.

Cellekultur Humane hjertefibroblaster (CF'er) isoleret fra human voksen ventrikel (HCF-av celle, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA) blev dyrket i medium indeholdende 10 % FBS, 1 % fibroblast væksttilskud og 1 % penicillin/streptomycin . Celler (1x10^5) blev podet i skåle med 10 cm diameter og blev dyrket i ovennævnte medium natten over.

Cellemigrationsassay Cellemigrationshastigheden i serum opnået fra hjertepatienter før og efter HIIT blev bestemt som beskrevet tidligere. Kort fortalt blev HCF-av-celler på 3000 udpladet på hver 3,5 cm petriskål med polyacrylamidsubstrater og blev høstet i medier indeholdende 10% hjertepatientsera før og efter HIIT. Fasekontrastbilleder blev optaget ved hjælp af et afkølet ladningskoblet enhedskamera (Photometrics, Tucson, AZ), fastgjort til et Eclipse Ti-E omvendt mikroskopsystem (Nikon Instruments Inc., Melville, NY) udstyret med en 20X, numerisk blænde 0,75 Achromat faseobjektivlinse og en INU-serie scenetop-inkubator (Tokai HIT Co., Ltd., Shizuoka-ken, Japan). Cellens position blev bestemt hvert 10. minut i en periode på 120-180 minutter baseret på kernens centrum. Migrationshastigheden blev beregnet ud fra den vedvarende tilfældige gang-ligning.

Celleproliferationsassay HCF-av-celler på 7,5x10^3 blev udpladet i hver brønd (0,95 cm^2 vækstareal) af en 48-brønds cellekulturplade (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) med almindeligt medium i 8 timer . De blev derefter dyrket i et udsultningsmedium indeholdende 1,5% FBS natten over. De fremstillede celler blev farvet med Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) i 15 minutter og blev derefter vasket to gange i phosphatbufret saltvand. De blev separat behandlet med 10 % FBS (10 brønde) og 10 % patientserum opnået fra vores forsøgspersoner før (24 brønde) og efter HIIT (24 brønde). Vi brugte IN Cell Analyzer 1000 cellulær billeddannelse og analysesystem (GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ) til at tælle celleantal 0, 24 timer og 48 timer efter høst med de tre forskellige dyrkningsmedier.

Proteomisk analyse Proteinkoncentrationer af forskellige behandlingsgrupper blev bestemt ved bicinchoninsyreassay (ThermoFisher Scientific Inc.). Proteinblandinger blev separeret ved elektroforese på 12,5% SDS-PAGE gel efterfulgt af in-gel enzymfordøjelse ifølge følgende procedure. Efter termisk denaturering ved 95 oC i 5 minutter blev proteinprøver reduceret ved tilsætning af dithiothreitol (DTT) til en slutkoncentration på 10 mM og inkuberet ved 50 oC i 30 minutter. Alkylering blev udført ved at tilsætte iodacetamid (IAA) til en slutkoncentration på 20 mM før inkubation ved stuetemperatur i 30 minutter i mørke. En anden alikvot af DTT blev derefter tilsat for at standse uomsat IAA. Til trypsinfordøjelse blev trypsin tilsat (1:50, vægt/vægt), og reaktionsblandingen blev inkuberet ved 37 oC i 12 timer. Trypsinfordøjelsen blev standset ved tilsætning af en 10 mikroL myresyre (10%). Fordøjede peptider blev tørret med speedvac til masseanalyse.

De tryptiske peptider blev analyseret på et LTQ-FT (lineær quadrupole ion trap-Fourier transformation ion cyclotron resonance) hybrid massespektrometer (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) udstyret med en nano-elektrospray ionkilde (New Objective, Inc. ., Woburn, MA) i positiv ion-tilstand. Væskekromatografisystemet var Agilent 1100 Series HPLC (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) med Famos autosampler (LC Packings, San Francisco, CA). Peptidopløsning blev injiceret på en selvpakket præsøjle (150 mikrom I.D. x 20 mm, 5 mikrom, 200 Å), og den kromatografiske adskillelse blev sekventielt udført på en selvpakket omvendt fase C18 nano-søjle (75 mikrom I.D. x 300 mm, 5 mikrom, 100 Å) ved at anvende 0,1% myresyre i vand (mobil fase A) og 0,1% myresyre i 80% acetonitril (mobil fase B). En lineær gradient fra 5 til 40 % mobil fase B i 40 minutter ved en strømningshastighed på 300 nL/min blev påført. Elektrosprayspænding blev påført ved 2,0 kV og kapillartemperaturen blev sat til 200 oC. En scanningscyklus blev påbegyndt med en fuld-scanningsundersøgelse MS-spektrum (m/z 300 - 2000) udført på FT-ICR massespektrometeret med opløsning på 100.000 ved 400 Da. Ti mest rigelige ioner påvist i denne scanning blev udsat for et MS/MS-eksperiment udført i det lineære quadrupole ionfælde (LTQ) massespektrometer. Ionakkumulering (Auto Gain Control-målnummer) og maksimal ionakkumuleringstid for fuld scanning og MS/MS blev sat til 1 x 106 ioner, 1000 ms og 5 x 104 ioner, 200 ms. Ioner blev fragmenteret ved brug af CID (kollisionsinduceret dissociation) med den normaliserede kollisionsenergi blev sat til 35 %, aktivering Q var 0,3 og aktiveringstiden var 30 ms.

Alle eksperiment RAW-filer blev udsat for MaxQuant (1.5.3.30) til den mærkefri proteinkvantificering. De variable post-translationelle modifikationer af søgeparametre i MaxQuant blev tildelt til at omfatte oxidation af methionin og phosphorylering af serin/threonin/tyrosin. Carbamidomethyleringen af ​​cystein blev tildelt som den fikserede modifikation. Enzymet til fordøjelse blev tildelt trypsin med den manglende spaltning nummer to. Homo Sapiens-proteinsekvenser fra SwissProt 2018_06 blev brugt til MS/MS-søgning. Proteinkvantificeringsresultater blev opnået ved LFQ-intensiteten fra MaxQuant.

Statistisk analyse Wilcoxon matched-pairs signed-ranks test blev brugt til at sammenligne træningskapacitetsparametre, CMR-LGE-resultater, blodkemidata og SF-36-score før og efter HIIT hos hvert individ. Student t-test blev brugt til at vurdere proteinniveauændringer før og efter HIIT.