심장 섬유증에 대한 인터벌 트레이닝 효과의 효과

2009년 1월 1일부터 2018년 12월 31일까지 임상 상태가 4주 이상 안정적인 심장병 환자는 36회의 HIIT를 완료했습니다. HIIT 전후에 임상 평가(아래 나열됨)가 있는 피험자가 포함됩니다.

*연령, 성별, 체질량 지수, 질병 기간, 동반 질환 및 투약 이력을 포함한 기준 정보를 검토했습니다. 심초음파 검사, 삶의 질에 대한 약식-36 건강 조사(SF-36), 단계적 심폐 운동 검사(CPET), 후기 가돌리늄 증강을 통한 심장 자기 공명 영상(CMR-LGE), 혈액 화학 검사(헤마토크리트, 뇌 나트륨 이뇨 펩타이드, 고감도 C 반응성 단백질, 크레아티닌), HIIT 전후 보존 혈청.*

세포 거동 인간 성인 심실에서 분리한 인간 심장 섬유아세포(HCF-av 세포, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA)를 10% FBS, 1% 섬유아세포 성장 보충제 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 배지에서 배양합니다. . 세포(1x10^5)를 직경 10cm 접시에 파종하고 위의 배지에서 밤새 배양하였다. 우리는 인간 성인 심실에서 분리된 인간 심장 섬유아세포(CF)를 치료하기 위해 10% 태아 소 혈청(FBS) 대신 환자 혈청의 10%를 사용했습니다(HCF-av 세포, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA). CF에 대한 혈청 효과를 평가하였다.

세포 배양 인간 성인 뇌실(HCF-av cell, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA)에서 분리한 인간 심장 섬유아세포(CF)를 10% FBS, 1% 섬유아세포 성장 보충제 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 배지에서 배양했습니다. . 세포(1x10^5)를 직경 10cm 접시에 파종하고 위의 배지에서 밤새 배양하였다.

세포 이동 분석 HIIT 전 및 후 심장 환자로부터 얻은 혈청의 세포 이동 속도는 이전에 설명한 대로 결정되었습니다. 요약하면, 3000개의 HCF-av 세포를 폴리아크릴아미드 기질이 있는 각 3.5cm 페트리 접시에 플레이팅하고 HIIT 전후에 심장 환자 혈청의 10%를 함유하는 배지에서 수확했습니다. 위상차 이미지는 20X, 개구수 0.75 Achromat이 장착된 Eclipse Ti-E 도립 현미경 시스템(Nikon Instruments Inc., Melville, NY)에 부착된 냉각 전하 결합 장치 카메라(Photometrics, Tucson, AZ)를 사용하여 기록되었습니다. 위상 대물렌즈 및 INU 시리즈 스테이지 탑 인큐베이터(Tokai HIT Co., Ltd., Shizuoka-ken, Japan). 세포의 위치는 핵의 중심을 기준으로 120-180분 동안 10분마다 결정되었다. 영구 임의 보행 방정식을 기반으로 마이그레이션 속도를 계산했습니다.

세포 증식 분석 7.5x10^3의 HCF-av 세포를 48-웰 세포 배양 플레이트(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)의 각 웰(0.95 cm^2 성장 영역)에 일반 배지와 함께 8시간 동안 플레이팅했습니다. . 그런 다음 1.5% FBS가 포함된 기아 배지에서 밤새 배양했습니다. 준비된 세포를 Hoechst 33342(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA)로 15분간 염색한 후 인산염 완충 식염수로 2회 세척하였다. 그들은 10% FBS(10웰)와 HIIT 전(24웰)과 HIIT 후(24웰)에서 대상자로부터 얻은 10% 환자 혈청으로 별도로 처리되었습니다. IN Cell Analyzer 1000 세포 이미징 및 분석 시스템(GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ)을 사용하여 세 가지 다른 배양 배지로 수확한 후 0, 24시간 및 48시간에 세포 수를 세었습니다.

Proteomic 분석 서로 다른 처리 그룹의 단백질 농도는 Bicinchoninic acid assay(ThermoFisher Scientific Inc.)로 측정했습니다. 단백질 혼합물을 12.5% ​​SDS-PAGE 겔에서 전기영동한 후 다음 절차에 따라 인-겔 효소 소화로 분리했습니다. 95oC에서 5분 동안 열 변성시킨 후, 단백질 샘플을 디티오트레이톨(DTT)을 첨가하여 최종 농도 10mM로 환원시키고 50oC에서 30분 동안 배양하였다. 암실에서 30분 동안 실온에서 배양하기 전에 iodoacetamide(IAA)를 최종 농도 20mM로 첨가하여 알킬화를 수행했습니다. 그런 다음 미반응 IAA를 켄칭하기 위해 DTT의 두 번째 분취량을 추가했습니다. 트립신 분해를 위해 트립신을 첨가하고(1:50, w/w) 반응 혼합물을 37 oC에서 12시간 동안 배양했습니다. 트립신 소화는 10 microL 포름산(10%)을 첨가하여 켄칭되었습니다. 소화된 펩티드는 질량 분석을 위해 speedvac에 의해 건조되었습니다.

트립신 펩타이드는 나노 전기분무 이온 소스(New Objective, Inc. ., Woburn, MA) 양이온 모드에서. 액체 크로마토그래피 시스템은 Famos 오토샘플러(LC Packings, San Francisco, CA)를 갖춘 Agilent 1100 시리즈 HPLC(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)였습니다. 펩타이드 용액을 self-packed precolumn(150 microm I.D. x 20 mm, 5 microm, 200 Å)에 주입하고 크로마토그래피 분리를 self-packed 역상 C18 nano-column(75 microm I.D. x 300 mm, 5 microm, 100 Å) 물(이동상 A)에 0.1% 포름산을 사용하고 80% 아세토니트릴(이동상 B)에 0.1% 포름산을 사용합니다. 300nL/분의 유속으로 40분 동안 5%에서 40% 이동상 B의 선형 구배를 적용했습니다. Electrospray 전압은 2.0 kV에서 적용되었고 모세관 온도는 200 oC로 설정되었습니다. 400Da에서 100,000의 해상도로 FT-ICR 질량 분석기에서 수행된 전체 스캔 조사 MS 스펙트럼(m/z 300 - 2000)으로 스캔 주기를 시작했습니다. 이 스캔에서 검출된 가장 풍부한 10개의 이온은 선형 사중극자 이온 트랩(LTQ) 질량 분석기에서 수행된 MS/MS 실험에 적용되었습니다. 전체 스캔 및 MS/MS에 대한 이온 축적(Auto Gain Control 대상 수) 및 최대 이온 축적 시간은 1 x 106 이온, 1000ms 및 5 x 104 이온, 200ms로 설정되었습니다. 정규화된 충돌 에너지가 35%로 설정되고 활성화 Q가 0.3이고 활성화 시간이 30ms인 CID(충돌 유도 해리)를 사용하여 이온을 단편화했습니다.

모든 실험 RAW 파일은 라벨 없는 단백질 정량을 위해 MaxQuant(1.5.3.30)에 적용되었습니다. MaxQuant에서 검색 매개변수의 번역 후 가변 수정은 메티오닌의 산화 및 세린/트레오닌/티로신의 인산화를 포함하도록 할당되었습니다. 시스테인의 카르바미도메틸화는 고정 변형으로 지정되었습니다. 소화를 위한 효소는 미스 절단 번호 2를 갖는 트립신으로 지정되었습니다. SwissProt 2018_06의 Homo Sapiens 단백질 서열을 MS/MS 검색에 사용했습니다. 단백질 정량 결과는 MaxQuant의 LFQ intensity로 얻었습니다.

통계 분석 Wilcoxon Matched-Pairs Signed-Ranks Test를 사용하여 각 개인의 HIIT 전후 운동 능력 매개변수, CMR-LGE 결과, 혈액 화학 데이터 및 SF-36 점수를 비교했습니다. 스튜던트 t 테스트는 HIIT 전후의 단백질 수준 변화를 평가하는 데 사용되었습니다.