Účinky účinků intervalového tréninku na srdeční fibrózu

Od 1. ledna 2009 do 31. prosince 2018 kardiaci se stabilním klinickým stavem po dobu delší než 4 týdny absolvovali 36krát HIIT. Budou zahrnuti jedinci s klinickým hodnocením (uvedeným níže) před a po HIIT.

*Byly přezkoumány výchozí informace, včetně věku, pohlaví, indexu tělesné hmotnosti, trvání onemocnění, komorbidit a historie léků. Subjekty s echokardiografickým vyšetřením, krátkou formou 36 zdravotního průzkumu (SF-36) pro kvality života, stupňovaným kardiopulmonálním zátěžovým testem (CPET), zobrazením srdeční magnetickou rezonancí s pozdním zesílením gadolinia (CMR-LGE), biochemickými testy krve (hematokrit, mozek natriuretický peptid, vysoce citlivý C-reaktivní protein, kreatinin) a konzervovaná séra před a po HIIT.*

Chování buněk Lidské srdeční fibroblasty (CF) izolované z komory dospělého člověka (buňka HCF-av, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA) se kultivují v médiu obsahujícím 10 % FBS, 1 % růstový doplněk fibroblastů a 1 % penicilin/streptomycin . Buňky (1x10^5) byly vysety do misek o průměru 10 cm a byly kultivovány ve výše uvedeném médiu přes noc. Použili jsme 10 % pacientského séra jako náhradu za 10% fetální bovinní sérum (FBS) k léčbě lidských srdečních fibroblastů (CF) izolovaných z lidské komory dospělých (buňka HCF-av, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA), a byly hodnoceny účinky séra na CF.

Buněčná kultura Lidské srdeční fibroblasty (CF) izolované z komory dospělého člověka (buňka HCF-av, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA) byly kultivovány v médiu obsahujícím 10 % FBS, 1 % růstový doplněk fibroblastů a 1 % penicilin/streptomycin . Buňky (1x10^5) byly vysety do misek o průměru 10 cm a byly kultivovány ve výše uvedeném médiu přes noc.

Test buněčné migrace Rychlost buněčné migrace v séru získaném od kardiaků před a po HIIT byla stanovena tak, jak bylo popsáno dříve. Stručně řečeno, buňky HCF-av 3000 byly naneseny na každou 3,5 cm Petriho misku s polyakrylamidovými substráty a byly sklizeny v médiu obsahujícím 10 % séra kardiaků před a po HIIT. Snímky s fázovým kontrastem byly zaznamenávány pomocí chlazené kamery zařízení s nábojovou vazbou (Photometrics, Tucson, AZ), připojené k systému inverzního mikroskopu Eclipse Ti-E (Nikon Instruments Inc., Melville, NY) vybaveného 20X, numerickou aperturou 0,75 Achromat fázové čočky objektivu a jevištní horní inkubátor řady INU (Tokai HIT Co., Ltd., Shizuoka-ken, Japonsko). Poloha buňky byla určována každých 10 minut po dobu 120-180 minut, na základě středu jádra. Rychlost migrace byla vypočtena na základě rovnice perzistentní náhodné chůze.

Test buněčné proliferace Buňky HCF-av 7,5x10^3 byly naneseny do každé jamky (0,95 cm^2 růstová plocha) 48jamkové destičky pro kultivaci buněk (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) s běžným médiem po dobu 8 hodin. . Poté byly kultivovány v hladovějícím médiu obsahujícím 1,5 % FBS přes noc. Připravené buňky byly obarveny Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) po dobu 15 minut a poté byly dvakrát promyty fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem. Byli odděleně ošetřeni 10% FBS (10 jamek) a 10% pacientským sérem získaným od našich subjektů před (24 jamek) a po HIIT (24 jamek). Použili jsme systém pro zobrazování a analýzu buněk IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ) k počítání počtu buněk v čase 0, 24 hodin a 48 hodin po sklizni se třemi různými kultivačními médii.

Proteomická analýza Koncentrace proteinu u různých léčených skupin byly stanoveny testem s kyselinou bicinchonovou (ThermoFisher Scientific Inc.). Směsi proteinů byly separovány elektroforézou na 12,5% SDS-PAGE gelu s následným enzymatickým štěpením v gelu podle následujícího postupu. Po tepelné denaturaci při 95 oC po dobu 5 minut byly proteinové vzorky zredukovány přidáním dithiothreitolu (DTT) na konečnou koncentraci 10 mM a inkubovány při 50 oC po dobu 30 minut. Alkylace byla provedena přidáním jodacetamidu (IAA) na konečnou koncentraci 20 mM před inkubací při teplotě místnosti po dobu 30 minut ve tmě. Poté byl přidán druhý alikvot DTT, aby se utlumila nezreagovaná IAA. Pro štěpení trypsinem byl přidán trypsin (1:50, w/w) a reakční směs byla inkubována při 37 °C po dobu 12 hodin. Štěpení trypsinem bylo zastaveno přidáním 10 ul kyseliny mravenčí (10 %). Štěpené peptidy byly vysušeny pomocí speedvac pro hmotnostní analýzu.

Tryptické peptidy byly analyzovány na hybridním hmotnostním spektrometru LTQ-FT (lineární kvadrupólová iontová past-Fourierova transformační iontová cyklotronová rezonance) (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) vybaveném nanoelektrosprejovým iontovým zdrojem (New Objective, Inc. ., Woburn, MA) v režimu kladných iontů. Systém kapalinové chromatografie byl Agilent 1100 Series HPLC (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) s automatickým vzorkovačem Famos (LC Packings, San Francisco, CA). Peptidový roztok byl nastříknut do samonaplněné předkolony (150 mikrom I.D. x 20 mm, 5 mikrom, 200 Á) a chromatografická separace byla postupně prováděna na samonaplněné C18 nano-kolonce s reverzní fází (75 mikrom I.D. x 300 mm, 5 mikrom, 100 Á) použitím 0,1% kyseliny mravenčí ve vodě (mobilní fáze A) a 0,1% kyseliny mravenčí v 80% acetonitrilu (mobilní fáze B). Byl aplikován lineární gradient od 5 do 40 % mobilní fáze B po dobu 40 minut při průtoku 300 nL/min. Elektrosprejové napětí bylo aplikováno na 2,0 kV a teplota kapiláry byla nastavena na 200 oC. Skenovací cyklus byl zahájen celoskenovacím MS spektrem (m/z 300 - 2000) provedeným na hmotnostním spektrometru FT-ICR s rozlišením 100 000 při 400 Da. Deset nejhojnějších iontů detekovaných v tomto skenu bylo podrobeno MS/MS experimentu prováděnému v lineárním quadrupólovém iontovém lapači (LTQ) hmotnostním spektrometru. Akumulace iontů (cílové číslo Auto Gain Control) a maximální doba akumulace iontů pro úplné skenování a MS/MS byly nastaveny na 1 x 106 iontů, 1000 ms a 5 x 104 iontů, 200 ms. Ionty byly fragmentovány pomocí CID (kolizí indukovaná disociace) s normalizovanou srážkovou energií nastavenou na 35 %, aktivace Q byla 0,3 a doba aktivace byla 30 ms.

Všechny experimentální soubory RAW byly podrobeny MaxQuant (1.5.3.30) pro kvantifikaci proteinu bez označení. Variabilní posttranslační modifikace vyhledávacích parametrů v MaxQuant byly přiřazeny tak, aby zahrnovaly oxidaci methioninu a fosforylaci serinu/threoninu/tyrosinu. Jako fixní modifikace byla přiřazena karbamidomethylace cysteinu. Enzym pro štěpení byl označen jako trypsin s chybným štěpením číslo dvě. Pro vyhledávání MS/MS byly použity proteinové sekvence Homo Sapiens ze SwissProt 2018_06. Výsledky kvantifikace proteinů byly získány pomocí intenzity LFQ z MaxQuant.

Statistická analýza Wilcoxonův test se znaménkovými páry byl použit k porovnání parametrů zátěžové kapacity, výsledků CMR-LGE, údajů o chemii krve a skóre SF-36 před a po HIIT u každého jedince. Studentův t test byl použit pro hodnocení změn hladiny proteinů před a po HIIT.