Efectos de los Efectos del Entrenamiento Interválico en la Fibrosis Cardíaca

Desde el 1 de enero de 2009 hasta el 31 de diciembre de 2018, los pacientes cardíacos con estado clínico estable durante más de 4 semanas completaron 36 veces de HIIT. Se incluirán sujetos con evaluaciones clínicas (enumeradas a continuación) antes y después del HIIT.

*Se revisó la información inicial, incluida la edad, el sexo, el índice de masa corporal, la duración de la enfermedad, las comorbilidades y el historial de medicación. Sujetos con examen ecocardiográfico, encuesta de salud forma corta-36 (SF-36) para calidad de vida, prueba de esfuerzo cardiopulmonar graduada (CPET), resonancia magnética cardíaca con realce tardío de gadolinio (CMR-LGE), pruebas de química sanguínea (hematocrito, cerebro péptido natriurético, proteína C reactiva de alta sensibilidad, creatinina) y sueros conservados antes y después de HIIT.*

Comportamientos celulares Los fibroblastos cardíacos humanos (FC) aislados del ventrículo adulto humano (células HCF-av, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, EE. UU.) se cultivan en un medio que contiene 10 % de FBS, 1 % de suplemento de crecimiento de fibroblastos y 1 % de penicilina/estreptomicina . Las células (1x10^5) se sembraron en platos de 10 cm de diámetro y se cultivaron en el medio anterior durante la noche. Utilizamos el 10 % del suero del paciente en sustitución del 10 % de suero fetal bovino (FBS) para tratar el fibroblasto cardíaco humano (CF) aislado del ventrículo humano adulto (célula HCF-av, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, EE. UU.), y se evaluaron los efectos del suero sobre la FQ.

Cultivo celular Se cultivaron fibroblastos cardíacos humanos (CF) aislados del ventrículo adulto humano (células HCF-av, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, EE. UU.) en medio que contenía 10 % de FBS, 1 % de suplemento de crecimiento de fibroblastos y 1 % de penicilina/estreptomicina . Las células (1x10^5) se sembraron en platos de 10 cm de diámetro y se cultivaron en el medio anterior durante la noche.

Ensayo de migración celular La velocidad de migración celular en el suero obtenido de pacientes cardíacos antes y después del HIIT se determinó como se describió anteriormente. En resumen, las células HCF-av de 3000 se sembraron en placas de Petri de 3,5 cm cada una con sustratos de poliacrilamida y se recolectaron en medios que contenían un 10 % de sueros de pacientes cardíacos antes y después del HIIT. Las imágenes de contraste de fase se registraron utilizando una cámara de dispositivo de carga acoplada enfriada (Photometrics, Tucson, AZ), conectada a un sistema de microscopio invertido Eclipse Ti-E (Nikon Instruments Inc., Melville, NY) equipado con un 20X, apertura numérica 0.75 Achromat lente de objetivo de fase y una incubadora superior de etapa de la serie INU (Tokai HIT Co., Ltd., Shizuoka-ken, Japón). La posición de la célula se determinó cada 10 min durante un período de 120-180 min, en función del centro del núcleo. La velocidad de migración se calculó en base a la ecuación de caminata aleatoria persistente.

Ensayo de proliferación celular Se sembraron células HCF-av de 7,5 x 10 ^ 3 en cada pocillo (0, 95 cm ^ 2 de área de crecimiento) de una placa de cultivo celular de 48 pocillos (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) con medio ordinario durante 8 horas . Luego se cultivaron en un medio de inanición que contenía FBS al 1,5 % durante la noche. Las células preparadas se tiñeron con Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) durante 15 minutos y luego se lavaron dos veces en solución salina tamponada con fosfato. Se trataron por separado con FBS al 10 % (10 pocillos) y suero del paciente al 10 % obtenido de nuestros sujetos antes (24 pocillos) y después del HIIT (24 pocillos). Utilizamos el sistema de análisis e imagen celular IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ) para contar el número de células a las 0, 24 horas y 48 horas después de la recolección con los tres medios de cultivo diferentes.

Análisis proteómico Las concentraciones de proteína de diferentes grupos de tratamiento se determinaron mediante ensayo de ácido bicinconínico (ThermoFisher Scientific Inc.). Las mezclas de proteínas se separaron mediante electroforesis en gel SDS-PAGE al 12,5 % seguido de digestión enzimática en el gel de acuerdo con el siguiente procedimiento. Después de la desnaturalización térmica a 95 oC durante 5 min, las muestras de proteína se redujeron mediante la adición de ditiotreitol (DTT) a una concentración final de 10 mM y se incubaron a 50 oC durante 30 min. La alquilación se realizó mediante la adición de yodoacetamida (IAA) a una concentración final de 20 mM antes de la incubación a temperatura ambiente durante 30 min en la oscuridad. A continuación, se añadió una segunda alícuota de DTT para extinguir el IAA que no había reaccionado. Para la digestión con tripsina, se añadió tripsina (1:50, p/p) y la mezcla de reacción se incubó a 37 oC durante 12 h. La digestión con tripsina se extinguió mediante la adición de 10 microL de ácido fórmico (10%). Los péptidos digeridos se secaron con speedvac para el análisis de masas.

Los péptidos trípticos se analizaron en un espectrómetro de masas híbrido LTQ-FT (trampa de iones de cuadrupolo lineal-resonancia de ciclotrón de iones de transformada de Fourier) (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) equipado con una fuente de iones de nanoelectrospray (New Objective, Inc. ., Woburn, MA) en modo de iones positivos. El sistema de cromatografía líquida fue el Agilent 1100 Series HPLC (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) con el automuestreador Famos (LC Packings, San Francisco, CA). La solución de péptido se inyectó en una precolumna autoempaquetada (150 microm D.I. x 20 mm, 5 microm, 200 Å) y la separación cromatográfica se realizó secuencialmente en una nanocolumna C18 de fase inversa autoempaquetada (75 microm D.I. x 300 mm, 5 micras, 100 Å) utilizando ácido fórmico al 0,1 % en agua (fase móvil A) y ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo al 80 % (fase móvil B). Se aplicó un gradiente lineal de 5 a 40% de fase móvil B durante 40 min a un caudal de 300 nL/min. Se aplicó voltaje de electropulverización a 2,0 kV y la temperatura del capilar se fijó en 200 oC. Se inició un ciclo de exploración con un espectro de MS de estudio de exploración completa (m/z 300 - 2000) realizado en el espectrómetro de masas FT-ICR con una resolución de 100.000 a 400 Da. Los diez iones más abundantes detectados en este escaneo se sometieron a un experimento de MS/MS realizado en el espectrómetro de masas de trampa de iones de cuadrupolo lineal (LTQ). La acumulación de iones (número objetivo del control automático de ganancia) y el tiempo máximo de acumulación de iones para exploración completa y MS/MS se establecieron en 1 x 106 iones, 1000 ms y 5 x 104 iones, 200 ms. Los iones se fragmentaron mediante el uso de CID (disociación inducida por colisión) con la energía de colisión normalizada ajustada al 35 %, el Q de activación fue de 0,3 y el tiempo de activación fue de 30 ms.

Todos los archivos RAW del experimento se sometieron a MaxQuant (1.5.3.30) para la cuantificación de proteínas sin etiquetas. Las modificaciones postraduccionales variables de los parámetros de búsqueda en MaxQuant se asignaron para incluir la oxidación de metionina y la fosforilación de serina/treonina/tirosina. La carbamidometilación de la cisteína se asignó como modificación fija. La enzima para la digestión se asignó a la tripsina con el número dos de división perdida. Se utilizaron secuencias de proteínas de Homo Sapiens de SwissProt 2018_06 para la búsqueda de MS/MS. Los resultados de la cuantificación de proteínas se obtuvieron mediante la intensidad LFQ de MaxQuant.

Análisis estadístico Se utilizó la prueba de rangos con signo de pares emparejados de Wilcoxon para comparar los parámetros de capacidad de ejercicio, los resultados de CMR-LGE, los datos de química sanguínea y las puntuaciones de SF-36 antes y después de HIIT en cada individuo. Se utilizó la prueba t de Student para evaluar los cambios en el nivel de proteínas antes y después del HIIT.