Efeitos dos Efeitos do Treinamento Intervalado na Fibrose Cardíaca

De 1º de janeiro de 2009 a 31 de dezembro de 2018, pacientes cardíacos com estado clínico estável por mais de 4 semanas completaram 36 vezes o HIIT. Indivíduos com avaliações clínicas (listadas abaixo) antes e depois do HIIT serão incluídos.

*As informações de base, incluindo idade, sexo, índice de massa corporal, duração da doença, comorbidades e histórico de medicamentos foram revisadas. Indivíduos com exame ecocardiográfico, questionário de saúde de forma curta-36 (SF-36) para qualidade de vida, teste de exercício cardiopulmonar graduado (CPET), ressonância magnética cardíaca com realce tardio de gadolínio (CMR-LGE), testes de química do sangue (hematócrito, cérebro peptídeo natriurético, proteína C reativa de alta sensibilidade, creatinina) e soro preservado antes e depois do HIIT.*

Comportamento celular Fibroblasto cardíaco humano (CF) isolado de ventrículo humano adulto (célula HCF-av, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, EUA) é cultivado em meio contendo 10% de FBS, 1% de suplemento de crescimento de fibroblasto e 1% de penicilina/estreptomicina . As células (1x10^5) foram semeadas em placas de 10 cm de diâmetro e cultivadas no meio acima durante a noite. Usamos 10% do soro do paciente em substituição ao soro fetal bovino (FBS) a 10% para tratar fibroblasto cardíaco humano (FC) isolado de ventrículo humano adulto (célula HCF-av, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, EUA), e os efeitos séricos na FC foram avaliados.

Cultura celular Fibroblastos cardíacos humanos (FCs) isolados de ventrículo humano adulto (célula HCF-av, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, EUA) foram cultivados em meio contendo 10% de FBS, 1% de suplemento de crescimento de fibroblastos e 1% de penicilina/estreptomicina . As células (1x10^5) foram semeadas em placas de 10 cm de diâmetro e cultivadas no meio acima durante a noite.

Ensaio de migração celular A velocidade de migração celular no soro obtido de pacientes cardíacos pré e pós-HIIT foi determinada conforme descrito anteriormente. Em resumo, células HCF-av de 3000 foram semeadas em placas de Petri de 3,5 cm com substratos de poliacrilamida e colhidas em meio contendo 10% de soros de pacientes cardíacos antes e depois do HIIT. As imagens de contraste de fase foram registradas usando uma câmera de dispositivo de carga acoplada resfriada (Photometrics, Tucson, AZ), conectada a um sistema de microscópio invertido Eclipse Ti-E (Nikon Instruments Inc., Melville, NY) equipado com uma abertura numérica de 20X 0,75 acromática lente objetiva de fase e uma incubadora de topo de estágio da série INU (Tokai HIT Co., Ltd., Shizuoka-ken, Japão). A posição da célula foi determinada a cada 10 minutos por um período de 120-180 minutos, com base no centro do núcleo. A velocidade de migração foi calculada com base na equação de caminhada aleatória persistente.

Ensaio de proliferação celular Células HCF-av de 7,5x10^3 foram semeadas em cada poço (área de crescimento de 0,95 cm^2) de uma placa de cultura de células de 48 poços (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) com meio comum por 8 horas . Eles foram então cultivados em um meio de inanição contendo 1,5% de FBS durante a noite. As células preparadas foram coradas com Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) durante 15 minutos e foram então lavadas duas vezes em solução salina tamponada com fosfato. Eles foram tratados separadamente com 10% de FBS (10 poços) e 10% de soro do paciente obtido de nossos indivíduos antes (24 poços) e depois do HIIT (24 poços). Usamos o sistema de imagem e análise celular IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ) para contar o número de células em 0, 24 horas e 48 horas após a colheita com os três meios de cultura diferentes.

Análise proteômica As concentrações de proteína de diferentes grupos de tratamento foram determinadas pelo ensaio de ácido bicinconínico (ThermoFisher Scientific Inc.). As misturas de proteínas foram separadas por eletroforese em gel SDS-PAGE a 12,5%, seguida de digestão enzimática em gel de acordo com o seguinte procedimento. Após desnaturação térmica a 95 oC por 5 min, as amostras de proteínas foram reduzidas por meio da adição de ditiotreitol (DTT) a uma concentração final de 10 mM e incubadas a 50 oC por 30 min. A alquilação foi realizada pela adição de iodoacetamida (IAA) a uma concentração final de 20 mM antes da incubação à temperatura ambiente por 30 min no escuro. Uma segunda alíquota de DTT foi então adicionada para extinguir IAA não reagido. Para a digestão da tripsina, foi adicionada tripsina (1:50, p/p) e a mistura reacional foi incubada a 37 oC por 12 h. A digestão com tripsina foi interrompida pela adição de 10 microL de ácido fórmico (10%). Os peptídeos digeridos foram secos por speedvac para análise de massa.

Os peptídeos trípticos foram analisados ​​em um espectrômetro de massa híbrido LTQ-FT (linear quadrupole ion trap-Fourier transform ion cyclotron ressonância) (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) equipado com uma fonte de íons nano-eletrospray (New Objective, Inc ., Woburn, MA) no modo de íon positivo. O sistema de cromatografia líquida foi o Agilent 1100 Series HPLC (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) com o amostrador automático Famos (LC Packings, San Francisco, CA). A solução de peptídeo foi injetada em uma pré-coluna auto-embalada (150 mícrons D.I. x 20 mm, 5 mícrons, 200 Å) e a separação cromatográfica foi realizada sequencialmente em uma nanocoluna C18 de fase reversa auto-embalada (75 mícrons I.D. x 300 mm, 5 mícrons, 100 Å) usando 0,1% de ácido fórmico em água (fase móvel A) e 0,1% de ácido fórmico em 80% de acetonitrila (fase móvel B). Foi aplicado um gradiente linear de 5 a 40% da fase móvel B por 40 min a uma vazão de 300 nL/min. A tensão de eletrospray foi aplicada a 2,0 kV e a temperatura capilar foi ajustada para 200 oC. Um ciclo de varredura foi iniciado com um espectro MS de varredura completa (m/z 300 - 2000) realizado no espectrômetro de massa FT-ICR com resolução de 100.000 a 400 Da. Dez íons mais abundantes detectados nesta varredura foram submetidos a um experimento MS/MS realizado no espectrômetro de massa linear quadrupole ion trap (LTQ). O acúmulo de íons (número alvo do controle de ganho automático) e o tempo máximo de acúmulo de íons para varredura completa e MS/MS foram definidos em 1 x 106 íons, 1000 ms e 5 x 104 íons, 200 ms. Os íons foram fragmentados pelo uso de CID (dissociação induzida por colisão) com a energia de colisão normalizada ajustada para 35%, o Q de ativação foi de 0,3 e o tempo de ativação foi de 30 ms.

Todos os arquivos RAW do experimento foram submetidos ao MaxQuant (1.5.3.30) para a quantificação de proteína livre de marcação. As modificações pós-traducionais variáveis ​​dos parâmetros de pesquisa no MaxQuant foram designadas para incluir a oxidação da metionina e a fosforilação da serina/treonina/tirosina. A carbamidometilação da cisteína foi designada como a modificação fixa. A enzima para a digestão foi designada como tripsina com a falha de clivagem número dois. Sequências de proteínas Homo Sapiens de SwissProt 2018_06 foram usadas para pesquisa MS/MS. Os resultados da quantificação de proteínas foram obtidos pela intensidade LFQ do MaxQuant.

Análise estatística O teste de postos sinalizados de pares combinados de Wilcoxon foi usado para comparar parâmetros de capacidade de exercício, resultados de CMR-LGE, dados de química do sangue e pontuações de SF-36 antes e depois do HIIT em cada indivíduo. O teste t de Student foi usado para avaliar as mudanças nos níveis de proteína antes e depois do HIIT.