间歇训练对心脏纤维化的影响

2009年1月1日至2018年12月31日，临床状态稳定大于4周的心脏病患者完成HIIT 36次。 将包括在 HIIT 之前和之后进行临床评估（如下所列）的受试者。

*审查了基线信息，包括年龄、性别、体重指数、病程、合并症和用药史。 受试者进行超声心动图检查、生活质量简表 36 健康调查 (SF-36)、分级心肺运动试验 (CPET)、晚期钆增强心脏磁共振成像 (CMR-LGE)、血液化学测试（血细胞比容、脑钠尿肽、高敏 C 反应蛋白、肌酐）和 HIIT 前后保存的血清。 *

细胞行为 从成人心室分离的人心脏成纤维细胞 (CF)（HCF-av 细胞，ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA）在含有 10% FBS、1% 成纤维细胞生长补充剂和 1% 青霉素/链霉素的培养基中培养. 将细胞 (1x10^5) 接种在直径为 10 厘米的培养皿中，并在上述培养基中培养过夜。 我们使用 10% 的患者血清代替 10% 的胎牛血清 (FBS) 来治疗从成人心室分离的人心脏成纤维细胞 (CF)（HCF-av 细胞，ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA），和血清对 CF 的影响进行了评估。

细胞培养 从成人心室分离的人心脏成纤维细胞 (CF)（HCF-av 细胞，ScienCell Research Laboratories，Carlsbad，CA，USA）在含有 10% FBS、1% 成纤维细胞生长补充剂和 1% 青霉素/链霉素的培养基中培养. 将细胞 (1x10^5) 接种在直径为 10 厘米的培养皿中，并在上述培养基中培养过夜。

细胞迁移测定 HIIT 前后的心脏病患者血清中的细胞迁移速度如前所述测定。 简而言之，将 3000 个 HCF-av 细胞接种在每个 3.5 厘米的带有聚丙烯酰胺底物的培养皿上，并在 HIIT 前后在含有 10% 心脏病患者血清的培养基中收获。 使用冷却的电荷耦合器件相机（Photometrics，T​​ucson，AZ）记录相差图像，该相机连接到 Eclipse Ti-E 倒置显微镜系统（Nikon Instruments Inc.，Melville，NY），配备 20X，数值孔径 0.75 Achromat相位物镜和 INU 系列舞台顶部培养箱（东海 HIT 有限公司，静冈县，日本）。 基于细胞核的中心，每 10 分钟确定一次细胞的位置，持续 120-180 分钟。 迁移速度是根据持续随机游走方程计算的。

细胞增殖试验 将 7.5x10^3 的 HCF-av 细胞接种到 48 孔细胞培养板（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO）的每个孔（0.95 cm^2 生长区域）中，用普通培养基培养 8 小时. 然后将它们在含有 1.5% FBS 的饥饿培养基中培养过夜。 准备好的细胞用 Hoechst 33342（Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，MA）染色 15 分钟，然后在磷酸盐缓冲盐水中洗涤两次。 他们分别用 10% FBS（10 孔）和 10% 从我们的受试者在 HIIT 之前（24 孔）和之后（24 孔）获得的患者血清进行处理。 我们使用 IN Cell Analyzer 1000 细胞成像和分析系统（GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ）在用三种不同的培养基收获细胞后 0、24 小时和 48 小时计算细胞数量。

蛋白质组学分析不同治疗组的蛋白质浓度通过二辛可宁酸测定法（ThermoFisher Scientific Inc.）测定。 根据以下程序，通过在 12.5% SDS-PAGE 凝胶上电泳，然后进行凝胶内酶消化，分离蛋白质混合物。 在 95 oC 下热变性 5 分钟后，通过添加二硫苏糖醇 (DTT) 将蛋白质样品还原至 10 mM 的最终浓度，并在 50 oC 下孵育 30 分钟。 在室温下避光孵育 30 分钟之前，通过添加碘乙酰胺 (IAA) 至最终浓度为 20 mM 进行烷基化。 然后加入第二份 DTT 以淬灭未反应的 IAA。 对于胰蛋白酶消化，加入胰蛋白酶（1:50，w/w）并将反应混合物在 37 oC 下孵育 12 小时。 通过添加 10 微升甲酸 (10%) 淬灭胰蛋白酶消化。 消化的肽通过 speedvac 干燥用于质量分析。

在配备纳米电喷雾离子源（New Objective, Inc. ., Woburn, MA) 在正离子模式下。 液相色谱系统是 Agilent 1100 系列 HPLC（Agilent Technologies, Palo Alto, CA）和 Famos 自动进样器（LC Packings, San Francisco, CA）。 将肽溶液注入自填充预柱（150 μm I.D. x 20 mm，5 μm，200 Å），并在自填充反相 C18 纳米柱（75 μm I.D. x 300 mm， 5 微米，100 Å)，使用 0.1% 甲酸水溶液（流动相 A）和 0.1% 甲酸 80% 乙腈溶液（流动相 B）。 应用从 5% 到 40% 流动相 B 的线性梯度，持续 40 分钟，流速为 300 nL/min。 电喷雾电压为 2.0 kV，毛细管温度设置为 200 oC。 扫描周期开始于在 400 Da 分辨率为 100,000 的 FT-ICR 质谱仪上执行的全扫描调查 MS 谱（m/z 300 - 2000）。 在该扫描中检测到的十个最丰富的离子在线性四极离子阱 (LTQ) 质谱仪中进行了 MS/MS 实验。 全扫描和 MS/MS 的离子累积（自动增益控制目标数）和最大离子累积时间分别设置为 1 x 106 个离子，1000 毫秒和 5 x 104 个离子，200 毫秒。 通过使用 CID（碰撞诱导解离）将离子碎片化，标准化碰撞能量设置为 35%，激活 Q 为 0.3，激活时间为 30 毫秒。

所有实验 RAW 文件都经过 MaxQuant (1.5.3.30) 进行无标签蛋白质定量。 MaxQuant 中搜索参数的可变翻译后修饰被指定为包括甲硫氨酸的氧化和丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸的磷酸化。半胱氨酸的氨基甲基化被指定为固定修饰。 用于消化的酶被指定为胰蛋白酶，具有第二个错误切割。 来自 SwissProt 2018_06 的智人蛋白质序列用于 MS/MS 搜索。 通过 MaxQuant 的 LFQ 强度获得蛋白质定量结果。

统计分析 Wilcoxon 配对符号秩检验用于比较每个人在 HIIT 前后的运动能力参数、CMR-LGE 结果、血液化学数据和 SF-36 评分。 学生 t 检验用于评估 HIIT 前后的蛋白质水平变化。