Effets de l'entraînement par intervalles Effets sur la fibrose cardiaque

Du 1er janvier 2009 au 31 décembre 2018, les patients cardiaques dont l'état clinique est stable depuis plus de 4 semaines ont effectué 36 séances de HIIT. Les sujets avec des évaluations cliniques (énumérés ci-dessous) avant et après HIIT seront inclus.

* Les informations de base, y compris l'âge, le sexe, l'indice de masse corporelle, la durée de la maladie, les comorbidités et les antécédents de médication ont été examinées. Sujets avec examen échocardiographique, questionnaire de santé abrégé-36 (SF-36) pour les qualités de vie, test d'effort cardiopulmonaire gradué (CPET), imagerie par résonance magnétique cardiaque avec injection tardive de gadolinium (CMR-LGE), tests de chimie sanguine (hématocrite, cerveau peptide natriurétique, protéine C-réactive de haute sensibilité, créatinine) et sérums conservés avant et après HIIT.*

Comportements cellulaires Les fibroblastes cardiaques humains (CF) isolés du ventricule adulte humain (cellule HCF-av, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA) sont cultivés dans un milieu contenant 10 % de FBS, 1 % de supplément de croissance des fibroblastes et 1 % de pénicilline/streptomycine . Les cellules (1x10^5) ont été ensemencées dans des boîtes de 10 cm de diamètre et ont été cultivées dans le milieu ci-dessus pendant une nuit. Nous avons utilisé 10 % du sérum du patient en remplacement du sérum de veau fœtal (FBS) à 10 % pour traiter le fibroblaste cardiaque humain (CF) isolé du ventricule humain adulte (HCF-av cell, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA), et les effets sériques sur la mucoviscidose ont été évalués.

Culture cellulaire Des fibroblastes cardiaques humains (FC) isolés du ventricule adulte humain (cellule HCF-av, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA) ont été cultivés dans un milieu contenant 10 % de FBS, 1 % de supplément de croissance des fibroblastes et 1 % de pénicilline/streptomycine . Les cellules (1x10^5) ont été ensemencées dans des boîtes de 10 cm de diamètre et ont été cultivées dans le milieu ci-dessus pendant une nuit.

Essai de migration cellulaire La vitesse de migration cellulaire dans le sérum obtenu à partir de patients cardiaques avant et après HIIT a été déterminée comme décrit précédemment. En bref, des cellules HCF-av de 3000 ont été étalées sur chaque boîte de Petri de 3,5 cm avec des substrats en polyacrylamide et ont été récoltées dans des milieux contenant 10 % de sérums de patients cardiaques avant et après HIIT. Les images à contraste de phase ont été enregistrées à l'aide d'un appareil photo à couplage de charge refroidi (Photometrics, Tucson, AZ), fixé à un système de microscope inversé Eclipse Ti-E (Nikon Instruments Inc., Melville, NY) équipé d'un 20X, ouverture numérique 0,75 Achromat lentille d'objectif de phase et un incubateur supérieur de scène de la série INU (Tokai HIT Co., Ltd., Shizuoka-ken, Japon). La position de la cellule a été déterminée toutes les 10 min pendant une période de 120 à 180 min, basée sur le centre du noyau. La vitesse de migration a été calculée sur la base de l'équation de la marche aléatoire persistante.

Test de prolifération cellulaire Des cellules HCF-av de 7,5 x 10 ^ 3 ont été étalées dans chaque puits (surface de croissance de 0,95 cm ^ 2) d'une plaque de culture cellulaire à 48 puits (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) avec du milieu ordinaire pendant 8 heures . Ils ont ensuite été cultivés dans un milieu de famine contenant 1,5 % de FBS pendant une nuit. Les cellules préparées ont été colorées avec Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) pendant 15 minutes et ont ensuite été lavées deux fois dans une solution saline tamponnée au phosphate. Ils ont été traités séparément avec 10 % de FBS (10 puits) et 10 % de sérum de patient obtenu de nos sujets avant (24 puits) et après HIIT (24 puits). Nous avons utilisé le système d'imagerie et d'analyse cellulaire IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ) pour compter le nombre de cellules à 0, 24 heures et 48 heures après la récolte avec les trois milieux de culture différents.

Analyse protéomique Les concentrations de protéines des différents groupes de traitement ont été déterminées par dosage de l'acide bicinchoninique (ThermoFisher Scientific Inc.). Les mélanges de protéines ont été séparés par électrophorèse sur gel SDS-PAGE à 12,5 % suivie d'une digestion enzymatique dans le gel selon la procédure suivante. Après dénaturation thermique à 95 oC pendant 5 min, les échantillons de protéines ont été réduits par addition de dithiothréitol (DTT) à une concentration finale de 10 mM et incubés à 50 oC pendant 30 min. L'alkylation a été réalisée en ajoutant de l'iodoacétamide (IAA) à une concentration finale de 20 mM avant incubation à température ambiante pendant 30 minutes dans l'obscurité. Une seconde aliquote de DTT a ensuite été ajoutée pour désactiver l'IAA n'ayant pas réagi. Pour la digestion à la trypsine, de la trypsine a été ajoutée (1:50, p/p) et le mélange réactionnel a été incubé à 37 oC pendant 12 h. La digestion à la trypsine a été stoppée par l'ajout de 10 microL d'acide formique (10%). Les peptides digérés ont été séchés par speedvac pour une analyse de masse.

Les peptides tryptiques ont été analysés sur un spectromètre de masse hybride LTQ-FT (piège à ions linéaire quadripolaire-résonance cyclotronique à transformée de Fourier) (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) équipé d'une source d'ions nano-électrospray (New Objective, Inc. ., Woburn, MA) en mode ions positifs. Le système de chromatographie en phase liquide était le HPLC Agilent série 1100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) avec l'échantillonneur automatique Famos (LC Packings, San Francisco, CA). La solution de peptide a été injectée sur une précolonne auto-garnie (150 microm I.D. x 20 mm, 5 microm, 200 Å) et la séparation chromatographique a été réalisée séquentiellement sur une nano-colonne auto-garnie en phase inversée C18 (75 microm I.D. x 300 mm, 5 microm, 100 Å) en utilisant 0,1 % d'acide formique dans l'eau (phase mobile A) et 0,1 % d'acide formique dans 80 % d'acétonitrile (phase mobile B). Un gradient linéaire de 5 à 40 % de phase mobile B pendant 40 min à un débit de 300 nL/min a été appliqué. La tension d'électronébulisation a été appliquée à 2,0 kV et la température capillaire a été fixée à 200 oC. Un cycle de balayage a été lancé avec un spectre MS de balayage complet (m/z 300 - 2000) effectué sur le spectromètre de masse FT-ICR avec une résolution de 100 000 à 400 Da. Les dix ions les plus abondants détectés dans ce balayage ont été soumis à une expérience MS/MS réalisée dans le spectromètre de masse à piège à ions quadripolaire linéaire (LTQ). L'accumulation d'ions (numéro cible Auto Gain Control) et le temps maximal d'accumulation d'ions pour le balayage complet et MS/MS ont été fixés à 1 x 106 ions, 1000 ms et 5 x 104 ions, 200 ms. Les ions ont été fragmentés en utilisant la CID (dissociation induite par collision) avec l'énergie de collision normalisée fixée à 35 %, l'activation Q était de 0,3 et le temps d'activation était de 30 ms.

Tous les fichiers RAW de l'expérience ont été soumis à MaxQuant (1.5.3.30) pour la quantification des protéines sans étiquette. Les modifications post-traductionnelles variables des paramètres de recherche dans MaxQuant ont été attribuées pour inclure l'oxydation de la méthionine et la phosphorylation de la sérine/thréonine/tyrosine. La carbamidométhylation de la cystéine a été désignée comme modification fixe. L'enzyme de digestion a été attribuée à la trypsine avec le numéro de clivage manqué deux. Les séquences de protéines Homo Sapiens de SwissProt 2018_06 ont été utilisées pour la recherche MS/MS. Les résultats de la quantification des protéines ont été obtenus par l'intensité LFQ de MaxQuant.

Analyse statistique Le test des rangs signés des paires appariées de Wilcoxon a été utilisé pour comparer les paramètres de capacité d'exercice, les résultats CMR-LGE, les données de chimie du sang et les scores SF-36 avant et après HIIT chez chaque individu. Le test t de Student a été utilisé pour évaluer les changements de niveau de protéines avant et après le HIIT.