Intervalliharjoittelun vaikutukset sydänfibroosiin

Tammikuun 1. 2009 ja 31. joulukuuta 2018 välisenä aikana sydänpotilaat, joilla on vakaa kliininen tila yli 4 viikkoa, ovat suorittaneet 36 kertaa HIIT:tä. Koehenkilöt, joilla on kliiniset arvioinnit (lueteltu alla) ennen ja jälkeen HIIT:n, otetaan mukaan.

*Perustiedot, mukaan lukien ikä, sukupuoli, painoindeksi, taudin kesto, rinnakkaissairaudet ja lääkityshistoria, tarkistettiin. Koehenkilöt, joilla on kaikukardiografinen tutkimus, lyhyt lomake-36 terveyskysely (SF-36) elämänlaatujen selvittämiseksi, asteittainen kardiopulmonaalinen rasitustesti (CPET), sydämen magneettikuvaus myöhäisellä gadoliniumin lisäyksellä (CMR-LGE), veren kemialliset testit (hematokriitti, aivot) natriureettinen peptidi, erittäin herkkä C-reaktiivinen proteiini, kreatiniini) ja säilötyt seerumit ennen ja jälkeen HIIT:n.*

Solujen käyttäytyminen Ihmisen aikuisen kammiosta eristettyjä ihmisen sydämen fibroblasteja (CF-av-solu, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA) viljellään väliaineessa, joka sisältää 10 % FBS:a, 1 % fibroblastien kasvulisää ja 1 % penisilliiniä/streptomysiiniä. . Solut (1 x 10^5) kylvettiin halkaisijaltaan 10 cm:n maljoihin ja niitä viljeltiin yllä olevassa alustassa yön yli. Käytimme 10 % potilaan seerumista korvaamaan 10 % fetal bovine seerumia (FBS) ihmisen sydämen fibroblastien (CF) hoitoon, joka oli eristetty ihmisen aikuisen kammiosta (HCF-av-solu, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA), ja seerumin vaikutukset CF:ään arvioitiin.

Soluviljely Ihmisen aikuisen kammiosta eristettyjä ihmisen sydämen fibroblasteja (HCF-av-solu, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA) viljeltiin väliaineessa, joka sisälsi 10 % FBS:a, 1 % fibroblastien kasvulisää ja 1 % penisilliiniä/streptomysiiniä. . Solut (1 x 10^5) kylvettiin halkaisijaltaan 10 cm:n maljoihin ja niitä viljeltiin yllä olevassa alustassa yön yli.

Solujen migraatiomääritys Solujen migraationopeus seerumissa, joka oli saatu sydänpotilailta ennen ja jälkeen HIIT:n, määritettiin kuten aiemmin on kuvattu. Lyhyesti sanottuna 3000 HCF-av-soluja maljattiin jokaiselle 3,5 cm:n petrimaljalle polyakryyliamidisubstraateilla ja ne kerättiin alustaan, joka sisälsi 10 % sydänpotilaan seerumeita ennen ja jälkeen HIIT:n. Vaihekontrastikuvat tallennettiin käyttämällä jäähdytettyä varauskytkettyä laitekameraa (Photometrics, Tucson, AZ), joka oli kiinnitetty käänteiseen Eclipse Ti-E -mikroskooppijärjestelmään (Nikon Instruments Inc., Melville, NY), joka oli varustettu 20-kertaisella numeerisella aukolla 0,75 Achromat vaiheobjektiivi ja INU-sarjan huippuhautomo (Tokai HIT Co., Ltd., Shizuoka-ken, Japani). Solun sijainti määritettiin 10 minuutin välein 120-180 minuutin ajan perustuen ytimen keskustaan. Muuttonopeus laskettiin jatkuvan satunnaiskävelyyhtälön perusteella.

Soluproliferaatiomääritys 7,5 x 10^3 HCF-av-soluja maljattiin 48-kuoppaisen soluviljelylevyn (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) jokaiseen kuoppaan (0,95 cm^2 kasvuala) tavallisella alustalla 8 tunnin ajaksi. . Sitten niitä viljeltiin 1,5 % FBS:ää sisältävässä nälänhätäalustassa yön yli. Valmistetut solut värjättiin Hoechst 33342:lla (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) 15 minuutin ajan ja pestiin sitten kahdesti fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa. Niitä käsiteltiin erikseen 10 %:lla FBS:llä (10 kuoppaa) ja 10 %:lla potilaan seerumia, joka oli saatu koehenkilöiltämme ennen (24 kuoppaa) ja sen jälkeen HIIT:tä (24 kuoppaa). Käytimme IN Cell Analyzer 1000 -solukuvaus- ja -analyysijärjestelmää (GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ) solujen lukumäärän laskemiseen 0, 24 tunnin ja 48 tunnin kohdalla kolmella eri elatusaineella keräämisen jälkeen.

Proteominen analyysi Eri käsittelyryhmien proteiinipitoisuudet määritettiin bisinkoniinihappomäärityksellä (ThermoFisher Scientific Inc.). Proteiiniseokset erotettiin elektroforeesilla 12,5-prosenttisella SDS-PAGE-geelillä, mitä seurasi geelin sisäinen entsyymihajotus seuraavan menettelyn mukaisesti. 5 minuutin lämpödenaturoinnin jälkeen 95 oC:ssa proteiininäytteet pelkistettiin lisäämällä ditiotreitolia (DTT) lopulliseen pitoisuuteen 10 mM ja inkuboitiin 50 oC:ssa 30 min. Alkylointi suoritettiin lisäämällä jodiasetamidia (IAA) lopulliseen pitoisuuteen 20 mM ennen inkubointia huoneenlämpötilassa 30 minuuttia pimeässä. Toinen alikvootti DTT:tä lisättiin sitten reagoimattoman IAA:n sammuttamiseksi. Trypsiinihajotusta varten lisättiin trypsiiniä (1:50, w/w) ja reaktioseosta inkuboitiin 37 oC:ssa 12 tuntia. Trypsiinihajotus sammutettiin lisäämällä 10 mikrolitraa muurahaishappoa (10 %). Pilkotut peptidit kuivattiin speedvacilla massaanalyysiä varten.

Tryptiset peptidit analysoitiin LTQ-FT (linear kvadrupoli ion trap-Fourier transform ion cyclotron resonance) hybridimassaspektrometrillä (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA), joka oli varustettu nanosähkösumutusionilähteellä (New Objective, Inc.) ., Woburn, MA) positiivisessa ionitilassa. Nestekromatografiajärjestelmä oli Agilent 1100 Series HPLC (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) ja Famos-automaattinäytteenottolaite (LC Packings, San Francisco, CA). Peptidiliuos injektoitiin itsepakattuun esikolonniin (150 mikrometriä sisähalkaisija x 20 mm, 5 mikrometriä, 200 Å) ja kromatografinen erotus suoritettiin peräkkäin itsepakattuun käänteisfaasi C18-nanokolonniin (75 mikrometrin sisähalkaisija x 300 mm, 5 mikrometriä, 100 Å) käyttämällä 0,1 % muurahaishappoa vedessä (liikkuva faasi A) ja 0,1 % muurahaishappoa 80 % asetonitriilissä (liikkuva faasi B). Käytettiin lineaarista gradienttia 5 - 40 % liikkuvaa faasia B 40 minuutin ajan virtausnopeudella 300 nl/min. Sähkösumutusjännite asetettiin 2,0 kV ja kapillaarilämpötila asetettiin 200 oC:een. Pyyhkäisysykli aloitettiin täyden pyyhkäisytutkimuksen MS-spektrillä (m/z 300 - 2000), joka suoritettiin FT-ICR-massaspektrometrillä resoluutiolla 100 000 400 Da:ssa. Kymmenen runsainta tässä skannauksessa havaittua ionia alistettiin MS/MS-kokeeseen, joka suoritettiin lineaarisella kvadrupoli-ioniloukun (LTQ) massaspektrometrillä. Ionien kertymä (Auto Gain Control -tavoiteluku) ja maksimi ionien kertymisaika täydessä skannauksessa ja MS/MS:ssä asetettiin arvoon 1 x 106 ionia, 1000 ms ja 5 x 104 ionia, 200 ms. Ionit fragmentoitiin käyttämällä CID:tä (törmäyksen aiheuttama dissosiaatio) normalisoidun törmäysenergian ollessa 35 %, aktivaatio Q oli 0,3 ja aktivaatioaika oli 30 ms.

Kaikki kokeen RAW-tiedostot altistettiin MaxQuantille (1.5.3.30) leimattoman proteiinin kvantitointia varten. Hakuparametrien vaihtelevat translaation jälkeiset muutokset MaxQuantissa määritettiin sisältämään metioniinin hapettumisen ja seriinin/treoniinin/tyrosiinin fosforylaation. Kysteiinin karbamidomeylaatio määritettiin kiinteäksi modifikaatioksi. Ruoansulatuksen entsyymiksi määritettiin trypsiini, jonka pilkkoutumispiste oli numero kaksi. SwissProt 2018_06:n Homo Sapiens -proteiinisekvenssejä käytettiin MS/MS-hakuun. Proteiinin kvantitointitulokset saatiin MaxQuantin LFQ-intensiteetillä.

Tilastollinen analyysi Wilcoxon matched-pairs signed-ranks -testiä käytettiin vertaamaan harjoituskapasiteettiparametreja, CMR-LGE-tuloksia, veren kemiallisia tietoja ja SF-36-pisteitä ennen ja jälkeen HIIT:n jokaisella yksilöllä. Studentin t-testillä arvioitiin proteiinitason muutoksia ennen ja jälkeen HIIT:n.