Effekter av intervalltreningseffekter på hjertefibrose

Fra 1. januar 2009 til 31. desember 2018 har hjertepasienter med stabil klinisk status i mer enn 4 uker fullført 36 ganger HIIT. Emner med kliniske vurderinger (listet nedenfor) før og etter HIIT vil bli inkludert.

*Utgangsinformasjon, inkludert alder, kjønn, kroppsmasseindeks, sykdomsvarighet, komorbiditeter og medisinhistorie ble gjennomgått. Forsøkspersoner med ekkokardiografisk undersøkelse, kort skjema-36 helseundersøkelse (SF-36) for livskvaliteter, gradert kardiopulmonal treningstest (CPET), magnetisk resonansavbildning av hjertet med sen gadoliniumforsterkning (CMR-LGE), blodkjemiprøver (hematokrit, hjerne) natriuretisk peptid, høysensitivt C-reaktivt protein, kreatinin), og konserverte sera før og etter HIIT.*

Celleatferd Human cardiac fibroblast (CF) isolert fra human voksen ventrikkel (HCF-av cell, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA) dyrkes i medium som inneholder 10 % FBS, 1 % fibroblastveksttilskudd og 1 % penicillin/streptomycin . Celler (1x10^5) ble sådd i skåler med 10 cm diameter og ble dyrket i mediet ovenfor over natten. Vi brukte 10 % av pasientserumet som erstatning for 10 % føtalt bovint serum (FBS) for å behandle human cardiac fibroblast (CF) isolert fra menneskelig voksen ventrikkel (HCF-av celle, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA), og serumeffekter på CF ble evaluert.

Cellekultur Humane hjertefibroblaster (CF-er) isolert fra menneskelig voksen ventrikkel (HCF-av-celle, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA) ble dyrket i medium som inneholdt 10 % FBS, 1 % fibroblastveksttilskudd og 1 % penicillin/streptomycin . Celler (1x10^5) ble sådd i skåler med 10 cm diameter og ble dyrket i mediet ovenfor over natten.

Cellemigrasjonsanalyse Cellemigrasjonshastigheten i serumet oppnådd fra hjertepasienter før og etter HIIT ble bestemt som beskrevet tidligere. Kort fortalt ble HCF-av-celler på 3000 belagt på hver 3,5-cm petriskål med polyakrylamidsubstrater og ble høstet i media som inneholdt 10% hjertepasientsera før og etter HIIT. Fasekontrastbilder ble tatt opp ved bruk av et avkjølt ladningskoblet enhetskamera (Photometrics, Tucson, AZ), festet til et Eclipse Ti-E invertert mikroskopsystem (Nikon Instruments Inc., Melville, NY) utstyrt med en 20X, numerisk blenderåpning 0,75 Achromat faseobjektivlinse og en inkubator i INU-serien (Tokai HIT Co., Ltd., Shizuoka-ken, Japan). Posisjonen til cellen ble bestemt hvert 10. minutt i en periode på 120-180 minutter, basert på sentrum av kjernen. Migrasjonshastigheten ble beregnet basert på den vedvarende tilfeldige gang-ligningen.

Celleproliferasjonsanalyse HCF-av-celler på 7,5x10^3 ble sådd ut i hver brønn (0,95 cm^2 vekstareal) av en 48-brønners cellekulturplate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) med vanlig medium i 8 timer . De ble deretter dyrket i et sultmedium inneholdende 1,5 % FBS over natten. De preparerte cellene ble farget med Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) i 15 minutter og ble deretter vasket to ganger i fosfatbufret saltvann. De ble separat behandlet med 10 % FBS (10 brønner) og 10 % pasientserum oppnådd fra våre forsøkspersoner før (24 brønner) og etter HIIT (24 brønner). Vi brukte IN Cell Analyzer 1000 cellulært bildebehandlings- og analysesystem (GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ) for å telle celletall 0, 24 timer og 48 timer etter høsting med de tre forskjellige kulturmediene.

Proteomisk analyse Proteinkonsentrasjoner av forskjellige behandlingsgrupper ble bestemt ved hjelp av bicinchoninsyreanalyse (ThermoFisher Scientific Inc.). Proteinblandinger ble separert ved elektroforese på 12,5% SDS-PAGE gel etterfulgt av in-gel enzymfordøyelse i henhold til følgende prosedyre. Etter termisk denaturering ved 95 oC i 5 minutter ble proteinprøver redusert ved tilsetning av ditiotreitol (DTT) til en sluttkonsentrasjon på 10 mM og inkubert ved 50 oC i 30 minutter. Alkylering ble utført ved å tilsette jodacetamid (IAA) til en sluttkonsentrasjon på 20 mM før inkubering ved romtemperatur i 30 minutter i mørket. En andre alikvot av DTT ble deretter tilsatt for å bråkjøle ureagert IAA. For trypsinfordøyelse ble trypsin tilsatt (1:50, w/w) og reaksjonsblandingen ble inkubert ved 37 oC i 12 timer. Trypsinfordøyelsen ble stoppet ved tilsetning av en 10 mikroL maursyre (10%). Fordøydte peptider ble tørket med speedvac for masseanalyse.

De tryptiske peptidene ble analysert på et LTQ-FT (lineær quadrupol ion trap-Fourier transform ion cyclotron resonance) hybrid massespektrometer (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) utstyrt med en nano-elektrospray-ionekilde (New Objective, Inc. ., Woburn, MA) i positiv ion-modus. Væskekromatografisystemet var Agilent 1100 Series HPLC (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) med Famos autosampler (LC Packings, San Francisco, CA). Peptidløsning ble injisert på en selvpakket prekolonne (150 mikrom I.D. x 20 mm, 5 mikrom, 200 Å) og den kromatografiske separasjonen ble sekvensielt utført på en selvpakket reversfase C18 nano-kolonne (75 mikrom I.D. x 300 mm, 5 mikrom, 100 Å) ved å bruke 0,1 % maursyre i vann (mobil fase A) og 0,1 % maursyre i 80 % acetonitril (mobil fase B). En lineær gradient fra 5 til 40 % mobil fase B i 40 minutter ved en strømningshastighet på 300 nL/min ble påført. Elektrosprayspenning ble påført ved 2,0 kV og kapillærtemperatur ble satt til 200 oC. En skanningssyklus ble initiert med et fullskanningsundersøkelse MS-spektrum (m/z 300 - 2000) utført på FT-ICR massespektrometer med oppløsning på 100 000 ved 400 Da. Ti mest tallrike ioner oppdaget i denne skanningen ble utsatt for et MS/MS-eksperiment utført i det lineære quadrupole ion trap (LTQ) massespektrometeret. Ioneakkumulering (Auto Gain Control målnummer) og maksimal ioneakkumuleringstid for fullskanning og MS/MS ble satt til 1 x 106 ioner, 1000 ms og 5 x 104 ioner, 200 ms. Ioner ble fragmentert ved bruk av CID (kollisjonsindusert dissosiasjon) med den normaliserte kollisjonsenergien ble satt til 35 %, aktivering Q var 0,3 og aktiveringstiden var 30 ms.

Alle eksperimentets RAW-filer ble utsatt for MaxQuant (1.5.3.30) for kvantifisering av etikettfri protein. De variable post-translasjonelle modifikasjonene av søkeparametere i MaxQuant ble tildelt å inkludere oksidasjon av metionin og fosforylering av serin/treonin/tyrosin. Karbamidometyleringen av cystein ble tildelt som den faste modifikasjonen. Enzymet for fordøyelsen ble tilordnet trypsin med miss-spaltningen nummer to. Homo Sapiens-proteinsekvenser fra SwissProt 2018_06 ble brukt til MS/MS-søk. Proteinkvantifiseringsresultater ble oppnådd ved LFQ-intensiteten fra MaxQuant.

Statistisk analyse Wilcoxon matched-pairs signed-ranks test ble brukt til å sammenligne treningskapasitetsparametere, CMR-LGE-resultater, blodkjemidata og SF-36-score før og etter HIIT hos hver enkelt. Student t-test ble brukt til å vurdere proteinnivåendringer før og etter HIIT.