Az intervallum edzés hatásai a szívfibrózisra

2009. január 1. és 2018. december 31. között a 4 hétnél hosszabb ideig stabil klinikai állapotú szívbetegek 36 alkalommal végeztek HIIT-t. A HIIT előtt és után klinikai értékelésen átesett (lásd alább felsorolt) alanyok is beletartoznak.

* Áttekintették az alapinformációkat, beleértve az életkort, a nemet, a testtömeg-indexet, a betegség időtartamát, a társbetegségeket és a gyógyszeres kezelési előzményeket. Echokardiográfiás vizsgálattal rendelkező alanyok, rövid forma-36-os állapotfelmérés (SF-36) az életminőségekre, fokozatos kardiopulmonális terhelési teszt (CPET), szívmágneses rezonancia képalkotás késői gadolínium-javítással (CMR-LGE), vérkémiai vizsgálatok (hematokrit, agy). natriuretikus peptid, nagy érzékenységű C-reaktív fehérje, kreatinin) és tartósított szérum a HIIT előtt és után.*

A sejtek viselkedése Az emberi felnőtt kamrából izolált humán szív fibroblasztokat (HCF-av sejt, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA) 10% FBS-t, 1% fibroblaszt növekedési kiegészítőt és 1% penicillint/sztreptomicint tartalmazó tápközegben tenyésztjük. . A sejteket (1x10^5) 10 cm átmérőjű edényekbe oltottuk, és a fenti tápközegben egy éjszakán át tenyésztettük. A 10%-os magzati szarvasmarha szérum (FBS) helyett a páciens szérumának 10%-át használtuk fel a humán felnőtt kamrából izolált humán szívfibroblaszt (CF) kezelésére (HCF-av sejt, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA), és a CF-re gyakorolt ​​szérumhatást értékelték.

Sejtkultúra Az emberi felnőtt kamrából izolált humán szív fibroblasztokat (HCF-av sejt, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA) 10% FBS-t, 1% fibroblaszt növekedési kiegészítést és 1% penicillint/sztreptomicint tartalmazó tápközegben tenyésztettünk. . A sejteket (1x10^5) 10 cm átmérőjű edényekbe oltottuk, és a fenti tápközegben egy éjszakán át tenyésztettük.

Sejtmigrációs vizsgálat A sejtmigrációs sebességet a szívbetegek HIIT előtti és utáni szérumában a korábban leírtak szerint határoztuk meg. Röviden, 3000 HCF-av sejtet szélesztettünk minden 3,5 cm-es Petri-csészékre poliakrilamid szubsztrátokkal, és 10% szívbeteg-szérumot tartalmazó tápközegben gyűjtöttük be a HIIT előtt és után. A fáziskontrasztos képeket egy hűtött töltéscsatolt kamerával (Photometrics, Tucson, AZ) rögzítettük, amely egy Eclipse Ti-E fordított mikroszkóp rendszerhez (Nikon Instruments Inc., Melville, NY) volt csatlakoztatva, 20X, numerikus apertúra 0,75 Achromat fázisú objektívlencsét és egy INU sorozatú színpadi felső inkubátort (Tokai HIT Co., Ltd., Shizuoka-ken, Japán). A sejt helyzetét 10 percenként határoztuk meg 120-180 percig, a sejtmag középpontja alapján. A migrációs sebességet a perzisztens véletlenszerű séta egyenlete alapján számítottuk ki.

Sejtproliferációs vizsgálat 7,5x10^3 méretű HCF-av sejteket szélesztettünk egy 48 lyukú sejttenyésztő lemez (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) minden egyes üregébe (0,95 cm^2 növekedési terület) közönséges tápközeggel 8 órára. . Ezután 1,5% FBS-t tartalmazó éheztetési tápközegben tenyésztettük egy éjszakán át. Az elkészített sejteket Hoechst 33342-vel (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) festettük 15 percig, majd kétszer mostuk foszfáttal pufferolt sóoldattal. Külön kezeltük őket 10% FBS-sel (10 lyuk), és 10% betegszérummal, amelyet alanyainktól szereztünk be a HIIT előtt (24 mérőhely) és után (24 lyuk). Az IN Cell Analyzer 1000 sejtalkotó és -elemző rendszert (GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ) használtuk a sejtek számának megszámlálására 0, 24 és 48 óra elteltével a három különböző tápközeggel végzett begyűjtés után.

Proteomikai analízis A különböző kezelési csoportok fehérjekoncentrációit Bicinchoninic acid assay-vel (ThermoFisher Scientific Inc.) határoztuk meg. A fehérjekeverékeket elektroforézissel választottuk el 12,5%-os SDS-PAGE gélen, majd gélben enzimes emésztést végeztünk a következő eljárás szerint. 95 oC-on 5 percig végzett termikus denaturálás után a fehérjemintákat ditiotreitol (DTT) hozzáadásával 10 mM végkoncentrációig redukáltuk, és 50 oC-on 30 percig inkubáltuk. Az alkilezést jód-acetamid (IAA) hozzáadásával végeztük 20 mM végső koncentrációig, mielőtt szobahőmérsékleten 30 percig sötétben inkubáltuk. Ezután egy második alikvot DTT-t adtunk hozzá a reagálatlan IAA leállítására. A tripszin emésztéshez tripszint (1:50, w/w) adtunk hozzá, és a reakcióelegyet 37 oC-on 12 órán át inkubáltuk. A tripszin emésztést 10 mikroliter hangyasav (10%) hozzáadásával leállítjuk. Az emésztett peptideket speedvac-mal szárítottuk tömegelemzés céljából.

A triptikus peptideket LTQ-FT (lineáris kvadrupól ioncsapda-Fourier transzformációs ionciklotron rezonancia) hibrid tömegspektrométeren (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA), amely nano-elektrospray ionforrással (New Objective, Inc.) volt felszerelve. ., Woburn, MA) pozitív ion módban. A folyadékkromatográfiás rendszer az Agilent 1100 sorozatú HPLC (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) volt Famos autosampler-rel (LC Packings, San Francisco, CA). A peptidoldatot egy öncsomagolt előoszlopra (150 mikrom belső átmérő x 20 mm, 5 mikrom, 200 Å) fecskendeztük, és a kromatográfiás elválasztást egymás után egy öncsomagolt, fordított fázisú C18 nanooszlopon (75 mikrom belső átmérő x 300 mm, 5 mikrom, 100 Å) 0,1% hangyasav vízben (A mozgófázis) és 0,1% hangyasav 80% acetonitrilben (B mozgó fázis) alkalmazásával. Lineáris gradienst alkalmaztunk 5-40% B mozgófázis között 40 percig 300 nl/perc áramlási sebesség mellett. Elektrospray feszültséget 2,0 kV-ra, a kapilláris hőmérsékletet 200 oC-ra állítottuk be. Egy pásztázási ciklust indítottunk egy teljes pásztázó MS spektrummal (m/z 300-2000), amelyet FT-ICR tömegspektrométeren végeztünk 100 000 felbontással 400 Da mellett. Az ebben a letapogatásban kimutatott tíz legnagyobb mennyiségben előforduló iont MS/MS kísérletnek vetettük alá lineáris kvadrupól ioncsapda (LTQ) tömegspektrométerrel. Az ionakkumuláció (Auto Gain Control célszám) és a maximális ionakkumulációs idő teljes letapogatás és MS/MS esetén 1 x 106 ion, 1000 ms és 5 x 104 ion, 200 ms volt. Az ionokat CID (ütközés által kiváltott disszociáció) segítségével fragmentáltuk, a normalizált ütközési energiát 35%-ra állítottuk, az aktiválás Q értéke 0,3 és az aktiválási idő 30 ms volt.

Minden kísérleti RAW-fájlt MaxQuant-nak (1.5.3.30) vetünk alá a címkementes fehérje mennyiségi meghatározásához. A MaxQuant keresési paramétereinek változó poszt-transzlációs módosításai közé tartozik a metionin oxidációja és a szerin/treonin/tirozin foszforilációja. Fix módosításként a cisztein karbamidometilezését jelöltük ki. Az emésztőenzimet a tripszinnek jelölték ki, amelynek hasítási száma kettes. A SwissProt 2018_06 Homo Sapiens fehérjeszekvenciáit használták az MS/MS kereséshez. A fehérje mennyiségi meghatározását a MaxQuant LFQ intenzitása alapján kaptuk.

Statisztikai elemzés A Wilcoxon matched-pairs signed-ranks tesztet a terhelési kapacitás paramétereinek, a CMR-LGE eredményeknek, a vérkémiai adatoknak és az SF-36 pontszámoknak a HIIT előtti és utáni összehasonlítására használtuk. A HIIT előtti és utáni fehérjeszint-változások felmérésére Student t tesztet használtunk.