Effekter av intervallträningseffekter på hjärtfibros

Från 1 januari 2009 till 31 december 2018 har hjärtpatienter med stabil klinisk status i mer än 4 veckor genomfört 36 gånger av HIIT. Ämnen med kliniska bedömningar (listade nedan) före och efter HIIT kommer att inkluderas.

*Baslinjeinformation, inklusive ålder, kön, kroppsmassaindex, sjukdomslängd, samtidiga sjukdomar och medicinhistorik granskades. Försökspersoner med ekokardiografisk undersökning, kortform-36 hälsoundersökning (SF-36) för livskvaliteter, graderat kardiopulmonellt träningstest (CPET), magnetisk resonanstomografi med sen gadoliniumförstärkning (CMR-LGE), blodkemiska tester (hematokrit, hjärna) natriuretisk peptid, högkänsligt C-reaktivt protein, kreatinin) och konserverade sera före och efter HIIT.*

Cellbeteende Mänsklig hjärtfibroblast (CF) isolerad från mänsklig vuxen ventrikel (HCF-av-cell, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA) odlas i medium innehållande 10 % FBS, 1 % fibroblasttillväxttillskott och 1 % penicillin/streptomycin . Celler (1x10^5) såddes i skålar med 10 cm diameter och odlades i ovanstående medium över natten. Vi använde 10 % av patientserumet som ersättning för 10 % fetalt bovint serum (FBS) för att behandla human hjärtfibroblast (CF) isolerad från mänsklig vuxen ventrikel (HCF-av cell, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA), och serumeffekter på CF utvärderades.

Cellkultur Humana hjärtfibroblaster (CF) isolerade från mänsklig vuxen ventrikel (HCF-av cell, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA) odlades i medium innehållande 10 % FBS, 1 % fibroblasttillväxttillskott och 1 % penicillin/streptomycin . Celler (1x10^5) såddes i skålar med 10 cm diameter och odlades i ovanstående medium över natten.

Cellmigrationsanalys Cellmigreringshastigheten i serumet som erhölls från hjärtpatienter före och efter HIIT bestämdes som beskrivits tidigare. I korthet ströks HCF-av-celler på 3000 ut på varje 3,5 cm petriskål med polyakrylamidsubstrat och skördades i media innehållande 10% hjärtpatientserum före och efter HIIT. Faskontrastbilder spelades in med en kyld laddningskopplad enhetskamera (Photometrics, Tucson, AZ), fäst till ett Eclipse Ti-E inverterat mikroskopsystem (Nikon Instruments Inc., Melville, NY) utrustat med en 20X, numerisk bländare 0,75 Achromat fasobjektivlins och en inkubator i INU-serien (Tokai HIT Co., Ltd., Shizuoka-ken, Japan). Cellens position bestämdes var 10:e minut under en period av 120-180 minuter, baserat på kärnans centrum. Migrationshastigheten beräknades baserat på den ihållande slumpmässiga promenadekvationen.

Cellproliferationsanalys HCF-av-celler på 7,5x10^3 ströks ut i varje brunn (0,95 cm^2 tillväxtarea) på en cellodlingsplatta med 48 brunnar (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) med vanligt medium under 8 timmar . De odlades sedan i ett svältmedium innehållande 1,5 % FBS över natten. De preparerade cellerna färgades med Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) under 15 minuter och tvättades sedan två gånger i fosfatbuffrad saltlösning. De behandlades separat med 10 % FBS (10 brunnar) och 10 % patientserum erhållet från våra försökspersoner före (24 brunnar) och efter HIIT (24 brunnar). Vi använde IN Cell Analyzer 1000 cellulärt avbildnings- och analyssystem (GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ) för att räkna cellantal vid 0, 24 timmar och 48 timmar efter skörd med de tre olika odlingsmedierna.

Proteomanalys Proteinkoncentrationer av olika behandlingsgrupper bestämdes med bicinchoninsyraanalys (ThermoFisher Scientific Inc.). Proteinblandningar separerades genom elektrofores på 12,5 % SDS-PAGE-gel följt av enzymspjälkning i gel enligt följande procedur. Efter termisk denaturering vid 95 oC under 5 minuter reducerades proteinprover genom tillsats av ditiotreitol (DTT) till en slutlig koncentration av 10 mM och inkuberades vid 50 oC i 30 minuter. Alkylering utfördes genom att tillsätta jodacetamid (IAA) till en slutlig koncentration av 20 mM före inkubation vid rumstemperatur under 30 minuter i mörker. En andra alikvot av DTT tillsattes sedan för att släcka oreagerad IAA. För trypsinklytning tillsattes trypsin (1:50, vikt/vikt) och reaktionsblandningen inkuberades vid 37 oC i 12 timmar. Trypsinklyvningen avbröts genom tillsats av en 10 mikroL myrsyra (10%). Digererade peptider torkades med speedvac för massanalys.

De tryptiska peptiderna analyserades på en LTQ-FT (linjär quadrupole ion trap-Fourier transform ion cyclotron resonance) hybridmasspektrometer (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) utrustad med en nanoelektrosprayjonkälla (New Objective, Inc. ., Woburn, MA) i positiv jonläge. Vätskekromatografisystemet var Agilent 1100 Series HPLC (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) med Famos autosampler (LC Packings, San Francisco, CA). Peptidlösning injicerades på en självpackad förkolonn (150 mikrom I.D. x 20 mm, 5 mikrom, 200 Å) och den kromatografiska separationen utfördes sekventiellt på en självpackad omvänd fas C18 nanokolonn (75 mikrom I.D. x 300 mm, 5 mikrom, 100 Å) genom att använda 0,1 % myrsyra i vatten (mobil fas A) och 0,1 % myrsyra i 80 % acetonitril (mobil fas B). En linjär gradient från 5 till 40 % mobil fas B under 40 min vid en flödeshastighet av 300 nL/min applicerades. Elektrosprayspänning applicerades vid 2,0 kV och kapillärtemperaturen sattes till 200 oC. En skanningscykel initierades med ett fullskannings-MS-spektrum (m/z 300 - 2000) utfört på FT-ICR-masspektrometern med en upplösning på 100 000 vid 400 Da. Tio mest förekommande joner som upptäckts i denna skanning utsattes för ett MS/MS-experiment utfört i den linjära kvadrupoljonfällan (LTQ) masspektrometern. Jonackumulering (Auto Gain Control målnummer) och maximal jonackumuleringstid för full-scan och MS/MS sattes till 1 x 106 joner, 1000 ms och 5 x 104 joner, 200 ms. Joner fragmenterades genom användning av CID (kollisionsinducerad dissociation) med den normaliserade kollisionsenergin inställd på 35 %, aktivering Q var 0,3 och aktiveringstiden var 30 ms.

Alla experiment RAW-filer utsattes för MaxQuant (1.5.3.30) för den etikettfria proteinkvantifieringen. De variabla post-translationella modifieringarna av sökparametrar i MaxQuant tilldelades inkludera oxidation av metionin och fosforylering av serin/treonin/tyrosin. Karbamidometyleringen av cystein tilldelades som den fixerade modifieringen. Enzymet för matsmältningen tilldelades vara trypsin med missklyvningen nummer två. Homo Sapiens-proteinsekvenser från SwissProt 2018_06 användes för MS/MS-sökning. Proteinkvantifieringsresultat erhölls genom LFQ-intensiteten från MaxQuant.

Statistisk analys Wilcoxon matchade par signerade rang-test användes för att jämföra träningskapacitetsparametrar, CMR-LGE-resultat, blodkemidata och SF-36-poäng före och efter HIIT hos varje individ. Student t-test användes för att bedöma proteinnivåförändringar före och efter HIIT.