Wpływ efektów treningu interwałowego na zwłóknienie serca

Od 1 stycznia 2009 do 31 grudnia 2018 pacjenci kardiolodzy ze stabilnym stanem klinicznym powyżej 4 tygodni ukończyli 36 razy HIIT. Osoby z ocenami klinicznymi (wymienione poniżej) przed i po HIIT zostaną uwzględnione.

*Przeanalizowano informacje wyjściowe, w tym wiek, płeć, wskaźnik masy ciała, czas trwania choroby, choroby współistniejące i historię leczenia. Pacjenci z badaniem echokardiograficznym, krótką ankietą stanu zdrowia 36 (SF-36) dotyczącą jakości życia, stopniowanym krążeniowo-oddechowym testem wysiłkowym (CPET), rezonansem magnetycznym serca z późnym wzmocnieniem gadolinowym (CMR-LGE), badaniami biochemicznymi krwi (hematokryt, peptyd natriuretyczny, wysokoczułe białko C-reaktywne, kreatynina) oraz konserwowane surowice przed i po HIIT.*

Zachowanie komórek Ludzkie fibroblasty sercowe (CF) wyizolowane z dorosłej komory człowieka (komórki HCF-av, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA) hoduje się w pożywce zawierającej 10% FBS, 1% suplementu wzrostu fibroblastów i 1% penicyliny/streptomycyny . Komórki (1x10^5) wysiano na szalki o średnicy 10 cm i hodowano w powyższej pożywce przez noc. Użyliśmy 10% surowicy pacjenta zamiast 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do leczenia ludzkich fibroblastów sercowych (CF) wyizolowanych z ludzkiej komory dorosłego (komórki HCF-av, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA), i oceniano wpływ surowicy na mukowiscydozę.

Hodowla komórkowa Ludzkie fibroblasty sercowe (CF) wyizolowane z ludzkiej dorosłej komory (komórka HCF-av, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA) hodowano w pożywce zawierającej 10% FBS, 1% suplementu wzrostu fibroblastów i 1% penicyliny/streptomycyny . Komórki (1x10^5) wysiano na szalki o średnicy 10 cm i hodowano w powyższej pożywce przez noc.

Test migracji komórek Szybkość migracji komórek w surowicy otrzymanej od pacjentów z sercem przed i po HIIT określono jak opisano wcześniej. W skrócie, komórki HCF-av 3000 wysiano na każdej 3,5-centymetrowej szalce Petriego z podłożami poliakryloamidowymi i zebrano w pożywce zawierającej 10% surowic pacjentów z sercem przed i po HIIT. Obrazy z kontrastem fazowym rejestrowano za pomocą kamery z chłodzonym urządzeniem ze sprzężeniem ładunkowym (Photometrics, Tucson, AZ), podłączonej do systemu odwróconego mikroskopu Eclipse Ti-E (Nikon Instruments Inc., Melville, NY) wyposażonego w 20-krotną aperturę numeryczną 0, 75 Achromat soczewka obiektywu fazowego i górny inkubator z serii INU (Tokai HIT Co., Ltd., Shizuoka-ken, Japonia). Pozycję komórki określano co 10 minut przez okres 120-180 minut, w oparciu o środek jądra. Szybkość migracji została obliczona na podstawie trwałego równania błądzenia losowego.

Test proliferacji komórek Komórki HCF-av o wielkości 7,5x10^3 umieszczono w każdej studzience (powierzchnia wzrostu 0,95 cm^2) 48-studzienkowej płytki do hodowli komórek (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ze zwykłą pożywką na 8 godzin . Następnie hodowano je przez noc w pożywce głodowej zawierającej 1,5% FBS. Przygotowane komórki barwiono Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) przez 15 minut, a następnie przemyto dwukrotnie roztworem soli buforowanym fosforanem. Byli oddzielnie traktowani 10% FBS (10 dołków) i 10% surowicą pacjentów uzyskaną od naszych pacjentów przed (24 dołkami) i po HIIT (24 dołki). Użyliśmy systemu obrazowania i analizy komórkowej IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ) do zliczenia liczby komórek w 0, 24 godziny i 48 godzin po zebraniu z trzema różnymi pożywkami hodowlanymi.

Analiza proteomiczna Stężenia białka w różnych grupach terapeutycznych określono za pomocą testu kwasu bicynchoninowego (ThermoFisher Scientific Inc.). Mieszaniny białek rozdzielono za pomocą elektroforezy na 12,5% żelu SDS-PAGE, a następnie trawienia enzymatycznego w żelu zgodnie z następującą procedurą. Po termicznej denaturacji w temperaturze 95 oC przez 5 minut, próbki białek redukowano przez dodanie ditiotreitolu (DTT) do końcowego stężenia 10 mM i inkubowano w temperaturze 50 oC przez 30 minut. Alkilację przeprowadzono przez dodanie jodoacetamidu (IAA) do końcowego stężenia 20 mM przed inkubacją w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności. Następnie dodano drugą porcję DTT w celu stłumienia nieprzereagowanego IAA. W celu trawienia trypsyną dodano trypsynę (1:50, w/w) i mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 37 oC przez 12 godzin. Trawienie trypsyną przerwano przez dodanie 10 mikrolitrów kwasu mrówkowego (10%). Trawione peptydy wysuszono w Speedvac do analizy masowej.

Peptydy trypsyny analizowano na hybrydowym spektrometrze masowym LTQ-FT (liniowa kwadrupolowa pułapka jonowa - rezonans cyklotronowy jonów z transformacją Fouriera) (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) wyposażonym w źródło jonów nano-elektrorozpylania (New Objective, Inc. ., Woburn, MA) w trybie jonów dodatnich. Systemem do chromatografii cieczowej był Agilent 1100 Series HPLC (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) z autosamplerem Famos (LC Packings, San Francisco, CA). Roztwór peptydu wstrzyknięto na samopakującą się kolumnę wstępną (150 mikrometrów średnicy wewnętrznej x 20 mm, 5 mikromów, 200 Å) i sekwencyjnie przeprowadzono rozdział chromatograficzny na samopakowanej nanokolumnie C18 z odwróconą fazą (75 mikrometrów średnicy wewnętrznej x 300 mm, 5 mikrometrów, 100 Å) przy użyciu 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie (faza ruchoma A) i 0,1% kwasu mrówkowego w 80% acetonitrylu (faza ruchoma B). Zastosowano liniowy gradient od 5 do 40% fazy ruchomej B przez 40 min przy szybkości przepływu 300 nl/min. Zastosowano napięcie elektrorozpylania 2,0 kV, a temperaturę kapilary ustawiono na 200 oC. Cykl skanowania rozpoczęto od pełnego skanowania widma MS (m/z 300 - 2000) przeprowadzonego na spektrometrze masowym FT-ICR z rozdzielczością 100 000 przy 400 Da. Dziesięć najbardziej obfitych jonów wykrytych w tym skanie poddano eksperymentowi MS/MS przeprowadzonemu w spektrometrze mas z liniową kwadrupolową pułapką jonową (LTQ). Akumulacja jonów (liczba docelowa automatycznej kontroli wzmocnienia) i maksymalny czas akumulacji jonów dla pełnego skanowania i MS/MS zostały ustawione na 1 x 106 jonów, 1000 ms i 5 x 104 jonów, 200 ms. Jony fragmentowano przy użyciu CID (dysocjacji wywołanej kolizją) przy znormalizowanej energii zderzenia ustawionej na 35%, aktywacja Q wynosiła 0,3, a czas aktywacji wynosił 30 ms.

Wszystkie eksperymentalne pliki RAW zostały poddane MaxQuant (1.5.3.30) w celu ilościowego oznaczenia białka bez znaczników. Zmienne potranslacyjne modyfikacje parametrów wyszukiwania w MaxQuant zostały przypisane tak, aby obejmowały utlenianie metioniny i fosforylację seryny/treoniny/tyrozyny. Jako stałą modyfikację przypisano karbamidometylację cysteiny. Enzym do trawienia został przypisany jako trypsyna z pomyłką rozszczepiania numer dwa. Sekwencje białek Homo Sapiens z SwissProt 2018_06 wykorzystano do wyszukiwania MS/MS. Wyniki oznaczania ilościowego białka uzyskano za pomocą intensywności LFQ z MaxQuant.

Analiza statystyczna Test dopasowanych par Wilcoxona został wykorzystany do porównania parametrów wydolności wysiłkowej, wyników CMR-LGE, danych biochemicznych krwi i wyników SF-36 przed i po HIIT u każdej osoby. Do oceny zmian poziomu białka przed i po treningu HIIT zastosowano test t-Studenta.