Effecten van intervaltraining Effecten op hartfibrose

Van 1 januari 2009 tot 31 december 2018 hebben hartpatiënten met een stabiele klinische status gedurende meer dan 4 weken 36 keer HIIT voltooid. Onderwerpen met klinische beoordelingen (hieronder vermeld) voor en na HIIT zullen worden opgenomen.

* Baseline-informatie, waaronder leeftijd, geslacht, body mass index, duur van de ziekte, comorbiditeiten en medicatiegeschiedenis werden beoordeeld. Proefpersonen met echocardiografisch onderzoek, korte vorm-36 gezondheidsenquête (SF-36) voor kwaliteit van leven, graduele cardiopulmonale inspanningstest (CPET), cardiale magnetische resonantiebeeldvorming met late gadoliniumverbetering (CMR-LGE), bloedchemietesten (hematocriet, natriuretisch peptide, zeer gevoelig C-reactief proteïne, creatinine), en geconserveerde sera voor en na HIIT.*

Celgedrag Menselijke cardiale fibroblasten (CF) geïsoleerd uit menselijk volwassen ventrikel (HCF-av-cel, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, VS) worden gekweekt in medium dat 10% FBS, 1% fibroblastgroeisupplement en 1% penicilline/streptomycine bevat . Cellen (1x10 ^ 5) werden gezaaid in schalen met een diameter van 10 cm en werden een nacht in het bovenstaande medium gekweekt. We gebruikten 10% van het patiëntenserum ter vervanging van het 10% foetaal runderserum (FBS) voor de behandeling van menselijke hartfibroblasten (CF) geïsoleerd uit menselijk volwassen ventrikel (HCF-av-cel, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, VS), en serumeffecten op CF werden geëvalueerd.

Celkweek Menselijke hartfibroblasten (CF's) geïsoleerd uit menselijk volwassen ventrikel (HCF-av-cel, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, VS) werden gekweekt in medium met 10% FBS, 1% fibroblastgroeisupplement en 1% penicilline / streptomycine . Cellen (1x10 ^ 5) werden gezaaid in schalen met een diameter van 10 cm en werden een nacht in het bovenstaande medium gekweekt.

Celmigratietest De celmigratiesnelheid in het serum verkregen van hartpatiënten pre- en post-HIIT werd bepaald zoals eerder beschreven. In het kort, HCF-av-cellen van 3000 werden uitgeplaat op elke petrischaal van 3,5 cm met polyacrylamidesubstraten en werden geoogst in media die 10% sera van hartpatiënten bevatten voor en na HIIT. Fasecontrastbeelden werden opgenomen met behulp van een gekoelde camera met ladingsgekoppeld apparaat (Photometrics, Tucson, AZ), bevestigd aan een Eclipse Ti-E omgekeerd microscoopsysteem (Nikon Instruments Inc., Melville, NY) uitgerust met een 20X, numerieke apertuur 0,75 Achromat fase-objectieflens en een incubator uit de INU-serie (Tokai HIT Co., Ltd., Shizuoka-ken, Japan). De positie van de cel werd elke 10 minuten bepaald gedurende een periode van 120-180 minuten, gebaseerd op het centrum van de kern. De migratiesnelheid werd berekend op basis van de persistent random walk-vergelijking.

Celproliferatietest HCF-av-cellen van 7,5 x 10^3 werden uitgeplaat in elk putje (0,95 cm^2 groeigebied) van een celkweekplaat met 48 putjes (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) met gewoon medium gedurende 8 uur . Ze werden vervolgens een nacht gekweekt in een uithongeringsmedium dat 1,5% FBS bevatte. De bereide cellen werden gekleurd met Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) gedurende 15 minuten en werden vervolgens tweemaal gewassen in met fosfaat gebufferde zoutoplossing. Ze werden afzonderlijk behandeld met 10% FBS (10 putjes) en 10% patiëntenserum verkregen van onze proefpersonen vóór (24 putjes) en na HIIT (24 putjes). We gebruikten IN Cell Analyzer 1000 cellulair beeldvormings- en analysesysteem (GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ) om celaantallen te tellen op 0, 24 uur en 48 uur na oogst met de drie verschillende kweekmedia.

Proteomische analyse Eiwitconcentraties van verschillende behandelingsgroepen werden bepaald door Bicinchonic acid assay (ThermoFisher Scientific Inc.). Eiwitmengsels werden gescheiden door elektroforese op 12,5% SDS-PAGE-gel gevolgd door in-gel-enzymdigestie volgens de volgende procedure. Na thermische denaturatie bij 95 oC gedurende 5 min, werden eiwitmonsters gereduceerd door toevoeging van dithiothreitol (DTT) tot een eindconcentratie van 10 mM en geïncubeerd bij 50 oC gedurende 30 min. Alkylering werd uitgevoerd door joodacetamide (IAA) toe te voegen tot een eindconcentratie van 20 mM voorafgaand aan incubatie bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten in het donker. Een tweede hoeveelheid DTT werd vervolgens toegevoegd om ongereageerd IAA te doven. Voor digestie met trypsine werd trypsine toegevoegd (1:50, w/w) en het reactiemengsel werd 12 uur bij 37°C geïncubeerd. De digestie met trypsine werd geblust door toevoeging van 10 microL mierenzuur (10%). Gedigesteerde peptiden werden gedroogd door speedvac voor massaanalyse.

De tryptische peptiden werden geanalyseerd op een LTQ-FT (lineaire quadrupool ion trap-Fourier transformatie ion cyclotron resonantie) hybride massaspectrometer (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) uitgerust met een nano-elektrospray ionenbron (New Objective, Inc. ., Woburn, MA) in positieve ionenmodus. Het vloeistofchromatografiesysteem was de Agilent 1100 Series HPLC (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) met de Famos autosampler (LC Packings, San Francisco, CA). Peptide-oplossing werd geïnjecteerd op een zelfverpakte voorkolom (150 microm I.D. x 20 mm, 5 microm, 200 A) en de chromatografische scheiding werd achtereenvolgens uitgevoerd op een zelfverpakte omgekeerde fase C18 nanokolom (75 microm I.D. x 300 mm, 5 microm, 100 Å) door 0,1% mierenzuur in water (mobiele fase A) en 0,1% mierenzuur in 80% acetonitril (mobiele fase B) te gebruiken. Er werd een lineaire gradiënt toegepast van 5 tot 40% mobiele fase B gedurende 40 minuten bij een stroomsnelheid van 300 nL/min. Electrospray voltage werd toegepast op 2,0 kV en capillaire temperatuur werd ingesteld op 200 oC. Er werd een scancyclus gestart met een MS-spectrumonderzoek met volledige scan (m/z 300 - 2000) uitgevoerd op de FT-ICR-massaspectrometer met een resolutie van 100.000 bij 400 Da. De tien meest voorkomende ionen die in deze scan werden gedetecteerd, werden onderworpen aan een MS/MS-experiment dat werd uitgevoerd in de lineaire quadrupool ion trap (LTQ) massaspectrometer. Ionenaccumulatie (Auto Gain Control-doelnummer) en maximale ionenaccumulatietijd voor volledige scan en MS/MS werden ingesteld op 1 x 106 ionen, 1000 ms en 5 x 104 ionen, 200 ms. Ionen werden gefragmenteerd door gebruik te maken van CID (botsing-geïnduceerde dissociatie) waarbij de genormaliseerde botsingsenergie was ingesteld op 35%, de activerings-Q was 0,3 en de activeringstijd was 30 ms.

Alle experimentele RAW-bestanden werden onderworpen aan MaxQuant (1.5.3.30) voor de labelvrije eiwitkwantificering. De variabele post-translationele modificaties van zoekparameters in MaxQuant werden toegewezen om de oxidatie van methionine en de fosforylering van serine/threonine/tyrosine te omvatten. De carbamidomethylering van cysteïne werd toegewezen als de vaste modificatie. Het enzym voor de spijsvertering werd toegewezen aan trypsine met de misser-splitsing nummer twee. Homo Sapiens-eiwitsequenties van SwissProt 2018_06 werden gebruikt voor MS/MS-zoekopdrachten. Eiwitkwantificeringsresultaten werden verkregen door de LFQ-intensiteit van MaxQuant.

Statistische analyse Wilcoxon matched-pairs ondertekend-rangentest werd gebruikt om parameters voor inspanningscapaciteit, CMR-LGE-resultaten, bloedchemiegegevens en SF-36-scores voor en na HIIT bij elk individu te vergelijken. Student t-test werd gebruikt om veranderingen in het eiwitniveau voor en na HIIT te beoordelen.