Влияние интервальных тренировок на сердечный фиброз

С 1 января 2009 г. по 31 декабря 2018 г. кардиологические пациенты со стабильным клиническим статусом в течение более 4 недель прошли ВИИТ 36 раз. Будут включены субъекты с клиническими оценками (перечисленными ниже) до и после HIIT.

*Была рассмотрена исходная информация, включая возраст, пол, индекс массы тела, продолжительность заболевания, сопутствующие заболевания и историю приема лекарств. Субъекты с эхокардиографическим обследованием, кратким опросом здоровья формы-36 (SF-36) для оценки качества жизни, градуированным кардиопульмональным нагрузочным тестом (CPET), магнитно-резонансной томографией сердца с поздним усилением гадолиния (CMR-LGE), анализами биохимии крови (гематокрит, головной мозг натрийуретический пептид, высокочувствительный С-реактивный белок, креатинин) и консервированные сыворотки до и после HIIT.*

Поведение клеток Фибробласты сердца человека (CF), выделенные из желудочка взрослого человека (клетки HCF-av, ScienCell Research Laboratories, Карлсбад, Калифорния, США), культивируют в среде, содержащей 10 % FBS, 1 % добавки для роста фибробластов и 1 % пенициллина/стрептомицина. . Клетки (1x10^5) высевали в чашки диаметром 10 см и культивировали в указанной выше среде в течение ночи. Мы использовали 10% сыворотки пациента вместо 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) для лечения сердечного фибробласта человека (CF), выделенного из желудочка взрослого человека (клетки HCF-av, ScienCell Research Laboratories, Карлсбад, Калифорния, США). оценивали влияние сыворотки на МВ.

Культура клеток Фибробласты сердца человека (CF), выделенные из желудочка взрослого человека (клетки HCF-av, ScienCell Research Laboratories, Карлсбад, Калифорния, США), культивировали в среде, содержащей 10 % FBS, 1 % добавки для роста фибробластов и 1 % пенициллина/стрептомицина. . Клетки (1x10^5) высевали в чашки диаметром 10 см и культивировали в указанной выше среде в течение ночи.

Анализ миграции клеток. Скорость миграции клеток в сыворотке, полученной от пациентов с сердечными заболеваниями до и после HIIT, определяли, как описано ранее. Вкратце, клетки HCF-av из 3000 высевали на каждую чашку Петри диаметром 3,5 см с полиакриламидными субстратами и собирали в среде, содержащей 10% сыворотки кардиологических пациентов до и после HIIT. Фазово-контрастные изображения были записаны с помощью охлаждаемой камеры прибора с зарядовой связью (Photometrics, Tucson, AZ), прикрепленной к системе инвертированного микроскопа Eclipse Ti-E (Nikon Instruments Inc., Melville, NY), оснащенной 20-кратным увеличением, числовой апертурой 0,75 Achrom. фазовый объектив и инкубатор с верхним столиком серии INU (Tokai HIT Co., Ltd., Сидзуока-кен, Япония). Положение клетки определяли каждые 10 мин в течение 120-180 мин, исходя из центра ядра. Скорость миграции рассчитывалась на основе уравнения постоянного случайного блуждания.

Анализ клеточной пролиферации Клетки HCF-av 7,5x10^3 высевали в каждую лунку (площадь роста 0,95 см^2) 48-луночного планшета для культивирования клеток (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) с обычной средой на 8 часов. . Затем их культивировали в голодной среде, содержащей 1,5% FBS, в течение ночи. Подготовленные клетки окрашивали Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) в течение 15 минут, а затем дважды промывали фосфатно-солевым буфером. Их отдельно обрабатывали 10% FBS (10 лунок) и 10% сывороткой пациентов, полученной от наших субъектов до (24 лунки) и после HIIT (24 лунки). Мы использовали систему визуализации и анализа клеток IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ) для подсчета количества клеток через 0, 24 часа и 48 часов после сбора с использованием трех различных культуральных сред.

Протеомный анализ. Концентрации белка в различных группах лечения определяли с помощью анализа на бицинхониновую кислоту (ThermoFisher Scientific Inc.). Белковые смеси разделяли электрофорезом на 12,5% SDS-PAGE геле с последующим ферментативным расщеплением в геле в соответствии со следующей процедурой. После термической денатурации при 95°С в течение 5 мин образцы белка восстанавливали добавлением дитиотреитола (ДТТ) до конечной концентрации 10 мМ и инкубировали при 50°С в течение 30 мин. Алкилирование проводили добавлением йодацетамида (ИУК) до конечной концентрации 20 мМ перед инкубацией при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте. Затем добавляли вторую аликвоту ДТТ для подавления непрореагировавшей ИУК. Для расщепления трипсином добавляли трипсин (1:50, вес/вес) и реакционную смесь инкубировали при 37 oC в течение 12 часов. Расщепление трипсином гасили добавлением 10 мкл муравьиной кислоты (10%). Расщепленные пептиды сушили спидваком для массового анализа.

Триптические пептиды анализировали на гибридном масс-спектрометре LTQ-FT (линейная квадрупольная ионная ловушка - ионно-циклотронный резонанс с преобразованием Фурье) (Thermo Fisher Scientific, Inc., Уолтем, Массачусетс), оснащенном источником ионов с наноэлектроспреем (New Objective, Inc.). ., Woburn, MA) в режиме положительных ионов. Система жидкостной хроматографии представляла собой ВЭЖХ серии Agilent 1100 (Agilent Technologies, Пало-Альто, Калифорния) с автоматическим пробоотборником Famos (LC Packings, Сан-Франциско, Калифорния). Раствор пептида вводили в самонабивающуюся предколонку (внутренний диаметр 150 мкм x 20 мм, 5 микром, 200 Å), и последовательно проводили хроматографическое разделение на самонабивающейся наноколонке C18 с обращенной фазой (внутренний диаметр 75 мкм x 300 мм, 5 мкм, 100 Å) с использованием 0,1% муравьиной кислоты в воде (подвижная фаза А) и 0,1% муравьиной кислоты в 80% ацетонитриле (подвижная фаза В). Применяли линейный градиент от 5 до 40% подвижной фазы В в течение 40 мин при скорости потока 300 нл/мин. Напряжение электрораспыления прикладывали к 2,0 кВ, а температуру капилляра устанавливали на уровне 200 oC. Цикл сканирования начинали с полного сканирования МС-спектра (m/z 300-2000), выполненного на масс-спектрометре FT-ICR с разрешением 100000 при 400 Да. Десять наиболее распространенных ионов, обнаруженных при этом сканировании, были подвергнуты эксперименту МС/МС, проведенному в масс-спектрометре с линейной квадрупольной ионной ловушкой (LTQ). Накопление ионов (номер цели автоматической регулировки усиления) и максимальное время накопления ионов для полного сканирования и МС/МС были установлены на 1 x 106 ионов, 1000 мс и 5 x 104 ионов, 200 мс. Ионы были фрагментированы с использованием CID (диссоциации, индуцированной столкновениями) с нормированной энергией столкновения, установленной на 35%, Q активации 0,3 и временем активации 30 мс.

Все экспериментальные файлы RAW были подвергнуты MaxQuant (1.5.3.30) для количественного определения белка без метки. Переменные посттрансляционные модификации параметров поиска в MaxQuant были отнесены к включению окисления метионина и фосфорилирования серина/треонина/тирозина. За фиксированную модификацию отнесли карбамидометилирование цистеина. Ферментом для пищеварения был назначен трипсин с номером промаха расщепления два. Последовательности белков Homo Sapiens из SwissProt 2018_06 использовались для поиска МС/МС. Результаты количественного определения белка были получены по интенсивности LFQ от MaxQuant.

Статистический анализ Для сравнения параметров переносимости физической нагрузки, результатов CMR-LGE, данных биохимического анализа крови и показателей SF-36 до и после HIIT у каждого человека использовался критерий Уилкоксона для сопоставления пар знаков. Для оценки изменения уровня белка до и после HIIT использовали t-критерий Стьюдента.