Auswirkungen von Intervalltrainingseffekten auf Herzfibrose

Vom 1. Januar 2009 bis zum 31. Dezember 2018 haben Herzpatienten mit einem stabilen klinischen Zustand für mehr als 4 Wochen 36 Mal HIIT absolviert. Probanden mit klinischen Bewertungen (unten aufgeführt) vor und nach HIIT werden eingeschlossen.

*Ausgangsinformationen, einschließlich Alter, Geschlecht, Body-Mass-Index, Dauer der Erkrankung, Komorbiditäten und Medikamentenanamnese, wurden überprüft. Probanden mit echokardiographischer Untersuchung, Kurzform-36-Gesundheitsbefragung (SF-36) zur Lebensqualität, Graded Cardiopulmonary Exercise Test (CPET), Herz-Magnetresonanztomographie mit später Gadolinium-Anreicherung (CMR-LGE), Blutchemie-Tests (Hämatokrit, Brain natriuretisches Peptid, hochempfindliches C-reaktives Protein, Kreatinin) und konservierte Seren vor und nach HIIT.*

Zellverhalten Humane kardiale Fibroblasten (CF), die aus humanen adulten Ventrikeln (HCF-av-Zelle, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA) isoliert wurden, werden in Medium kultiviert, das 10 % FBS, 1 % Fibroblasten-Wachstumsergänzung und 1 % Penicillin/Streptomycin enthält . Zellen (1 x 10^5) wurden in Schalen mit 10 cm Durchmesser ausgesät und über Nacht in dem obigen Medium kultiviert. Wir verwendeten 10 % des Patientenserums als Ersatz für 10 % fötales Rinderserum (FBS), um menschliche Herzfibroblasten (CF) zu behandeln, die aus menschlichen Ventrikeln von Erwachsenen isoliert wurden (HCF-av-Zelle, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA). und Serumwirkungen auf CF wurden bewertet.

Zellkultur Menschliche kardiale Fibroblasten (CFs), die aus menschlichen Ventrikeln von Erwachsenen (HCF-av-Zelle, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA) isoliert wurden, wurden in Medium kultiviert, das 10 % FBS, 1 % Fibroblasten-Wachstumsergänzung und 1 % Penicillin/Streptomycin enthielt . Zellen (1 x 10^5) wurden in Schalen mit 10 cm Durchmesser ausgesät und über Nacht in dem obigen Medium kultiviert.

Zellmigrationsassay Die Zellmigrationsgeschwindigkeit im Serum, das von Herzpatienten vor und nach HIIT erhalten wurde, wurde wie zuvor beschrieben bestimmt. Kurz gesagt, HCF-av-Zellen von 3000 wurden auf jede 3,5-cm-Petrischale mit Polyacrylamidsubstraten plattiert und wurden vor und nach HIIT in Medien geerntet, die 10 % Herzpatientenseren enthielten. Phasenkontrastbilder wurden unter Verwendung einer gekühlten Charge-Coupled-Device-Kamera (Photometrics, Tucson, AZ) aufgezeichnet, die an einem Eclipse Ti-E-Umkehrmikroskopsystem (Nikon Instruments Inc., Melville, NY) angebracht war, das mit einem 20X-Achromat mit numerischer Apertur von 0,75 ausgestattet war Phasenobjektivlinse und einen Bühneninkubator der INU-Serie (Tokai HIT Co., Ltd., Shizuoka-ken, Japan). Die Position der Zelle wurde alle 10 min für einen Zeitraum von 120–180 min, bezogen auf das Zentrum des Zellkerns, bestimmt. Die Migrationsgeschwindigkeit wurde basierend auf der Persistent-Random-Walk-Gleichung berechnet.

Zellproliferationsassay HCF-av-Zellen von 7,5 × 10 3 wurden in jede Vertiefung (Wachstumsbereich 0,95 cm 2 ) einer Zellkulturplatte mit 48 Vertiefungen (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) mit gewöhnlichem Medium für 8 Stunden plattiert . Sie wurden dann über Nacht in einem Hungermedium kultiviert, das 1,5 % FBS enthielt. Die präparierten Zellen wurden mit Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) für 15 Minuten gefärbt und wurden dann zweimal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Sie wurden separat mit 10 % FBS (10 Vertiefungen) und 10 % Patientenserum behandelt, das von unseren Probanden vor (24 Vertiefungen) und nach HIIT (24 Vertiefungen) erhalten wurde. Wir verwendeten das zelluläre Bildgebungs- und Analysesystem IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ), um die Zellzahlen 0, 24 Stunden und 48 Stunden nach der Ernte mit den drei verschiedenen Kulturmedien zu zählen.

Proteomische Analyse Proteinkonzentrationen verschiedener Behandlungsgruppen wurden durch Bicinchoninsäure-Assay (ThermoFisher Scientific Inc.) bestimmt. Proteingemische wurden durch Elektrophorese auf 12,5 % SDS-PAGE-Gel aufgetrennt, gefolgt von Enzymverdau im Gel gemäß dem folgenden Verfahren. Nach thermischer Denaturierung bei 95 oC für 5 min wurden die Proteinproben durch die Zugabe von Dithiothreitol (DTT) auf eine Endkonzentration von 10 mM reduziert und 30 min bei 50 oC inkubiert. Die Alkylierung wurde durch Zugabe von Jodacetamid (IAA) bis zu einer Endkonzentration von 20 mM vor der Inkubation bei Raumtemperatur für 30 min im Dunkeln durchgeführt. Ein zweites Aliquot von DTT wurde dann zugegeben, um nicht umgesetztes IAA zu quenchen. Für den Trypsinverdau wurde Trypsin zugegeben (1:50, w/w) und die Reaktionsmischung wurde bei 37°C für 12 h inkubiert. Der Trypsinverdau wurde durch die Zugabe von 10 Mikroliter Ameisensäure (10 %) gequencht. Verdaute Peptide wurden durch Speedvac für die Massenanalyse getrocknet.

Die tryptischen Peptide wurden auf einem LTQ-FT (lineares Quadrupol-Ionenfalle-Fourier-Transformations-Ionen-Zyklotron-Resonanz)-Hybrid-Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) analysiert, das mit einer Nano-Elektrospray-Ionenquelle (New Objective, Inc.) ausgestattet war ., Woburn, MA) im positiven Ionenmodus. Das Flüssigchromatographiesystem war das Agilent 1100 Series HPLC (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) mit dem Famos Autosampler (LC Packings, San Francisco, CA). Die Peptidlösung wurde auf eine selbstgepackte Vorsäule (150 Mikrometer I.D. x 20 mm, 5 Mikrom, 200 Å) injiziert und die chromatographische Trennung wurde nacheinander auf einer selbstgepackten Umkehrphasen-C18-Nanosäule (75 Mikrom I.D. x 300 mm, 5 Mikrometer, 100 Å) unter Verwendung von 0,1 % Ameisensäure in Wasser (Laufmittel A) und 0,1 % Ameisensäure in 80 % Acetonitril (Laufmittel B). Ein linearer Gradient von 5 bis 40 % der mobilen Phase B wurde für 40 min bei einer Flussrate von 300 nL/min angelegt. Die Elektrospray-Spannung wurde auf 2,0 kV angelegt und die Kapillartemperatur wurde auf 200°C eingestellt. Ein Scan-Zyklus wurde mit einem Full-Scan-Übersichts-MS-Spektrum (m/z 300–2000) initiiert, das auf dem FT-ICR-Massenspektrometer mit einer Auflösung von 100.000 bei 400 Da durchgeführt wurde. Die zehn häufigsten Ionen, die in diesem Scan nachgewiesen wurden, wurden einem MS/MS-Experiment unterzogen, das im Massenspektrometer mit linearer Quadrupol-Ionenfalle (LTQ) durchgeführt wurde. Die Ionenakkumulation (Auto Gain Control Target Number) und die maximale Ionenakkumulationszeit für Full-Scan und MS/MS wurden auf 1 x 106 Ionen, 1000 ms und 5 x 104 Ionen, 200 ms eingestellt. Ionen wurden unter Verwendung von CID (kollisionsinduzierte Dissoziation) fragmentiert, wobei die normalisierte Kollisionsenergie auf 35 % eingestellt war, das Aktivierungs-Q 0,3 betrug und die Aktivierungszeit 30 ms betrug.

Alle Experiment-RAW-Dateien wurden MaxQuant (1.5.3.30) für die markierungsfreie Proteinquantifizierung unterzogen. Den variablen posttranslationalen Modifikationen von Suchparametern in MaxQuant wurde die Oxidation von Methionin und die Phosphorylierung von Serin/Threonin/Tyrosin zugeordnet. Als fixe Modifikation wurde die Carbamidomethylierung von Cystein zugeordnet. Dem Verdauungsenzym wurde Trypsin mit der Miss-Spaltung Nummer zwei zugeordnet. Homo Sapiens-Proteinsequenzen aus SwissProt 2018_06 wurden für die MS/MS-Suche verwendet. Die Ergebnisse der Proteinquantifizierung wurden anhand der LFQ-Intensität von MaxQuant erhalten.

Statistische Analyse Der Wilcoxon Matched-Pairs Signed-Rangs-Test wurde verwendet, um Belastungsparameter, CMR-LGE-Ergebnisse, Blutchemiedaten und SF-36-Scores vor und nach HIIT bei jeder Person zu vergleichen. Der Student-t-Test wurde verwendet, um die Veränderungen des Proteinspiegels vor und nach HIIT zu beurteilen.