コレステロール個人の脂質異常症および酸化ストレスに対するLentinula Edodesバーの効果：無作為化研究

研究デザイン 研究の主な結果は、総コレステロール値、トリグリセリドまたは低密度リポタンパク質 (LDL) および高密度リポタンパク質 (HDL) によって評価されるコレステロール血症でした。 副次的な結果には、血糖値、体格指数 (BMI)、および酸化ストレスのバイオマーカーが含まれていました。

2018 年 9 月から 2018 年 12 月にかけて、第 II 相無作為二重盲検プラセボ対照試験が実施されました。 この研究は、ブラジルのサンパウロ州にあるソロカバ大学 (UNISO) で行われました。 この研究は、国立保健評議会の決議 466/2012 (ブラジル、2012 年) および研究倫理審査委員会 (ERC) に従って、ソロカバ大学の人間研究倫理委員会 (議定書番号 2.824.297) によって承認されました (付録 D)。 （WHO、2016）。

個人の募集 個人の募集については、フェーズ II 試験開始の 5 か月前に開示が開始されました。 この研究は、ソロカバ大学 (UNISO) のウェブサイト、キャンパス全体に配布されたソーシャル メディアおよびフォルダーで公開され、研究、包含および除外基準、および研究者の連絡先に関する簡単な説明が含まれています。 Anvisa (National Health Surveillance Agency) の決議 1.170 によると、第 II 相試験は 12 人未満では許可されていません。ただし、当局は最低 24 人のボランティアを使用することを提案しています。

適格基準 合計 165 人が Google のオンライン アンケートに回答しました。

• 包含基準 20 歳から 65 歳までの男女で、以下の生化学的マーカーの少なくとも 1 つを境界レベル (総コレステロール 180 から 239 mg/dL、LDL 130 から 159 mg/dL、トリグリセリド 150 200 mg/dL まで) が募集され、募集日までの最近の日付で生化学検査によって診断されました。 バー成分とシイタケに寛容であること。 -採血の日時に出席できること。
• 除外基準しかし、それらのいくつかは、癌、心臓病、神経変性疾患、糖尿病などの病気にかかっていました。 これらの病気は研究の交絡因子と見なされる可能性があり、一部の募集された人々は除外されなければなりませんでした. 妊娠中、授乳中、ホルモン補充療法中の女性も参加できませんでした。

個人は、研究中の食習慣とパターン、身体活動レベル、または経口避妊薬の使用を変更しないように指示されたため、暴露グループに対する各個人の食事に追加されたしいたけの影響のみが特定されました.

研究介入。 この研究は、インフォームド コンセントの条件に署名した 68 人の個人から正式に開始されました。 1 回目 (時間 0 - T0)、2 回目 (時間 33 日 - T33)、および 3 回目 (時間 66 日 - T66) の会議で、被験者は栄養評価と既往歴、食習慣の 24 時間のリコールを受けました。そして食べる頻度。

研究の最初の月に 4,100 のプラセボまたはマッシュルーム バーが製造され、2 番目の月には 3,500 バーが製造されました。 Grotto と協力者 (2015) によると、動物の毒性の程度を判断するために、さまざまなシイタケ濃度 (100、400、および 800 mg/Kg/日) を評価する研究を実施しました。 シイタケ濃度 100 mg/Kg/日が安全であることが示されています。 また、シイタケのスイートバー配合は、前回調査の官能検査と購入意向で認められました。

無作為化 個人 (68) を (乱数表を使用して) 2 つのグループにランダムに割り当てました: I - プラセボ グループ (n = 32) および II - 介入グループ (n = 36)。 しいたけの 1 日あたりの推奨摂取量 100 mg/Kg/日を確保するために、各参加者の体重を測定して、1 日あたりのシイタケの摂取本数を決定しました。

栄養評価と採血の後、個人はT33日間、個別の真空バーを含む未確認の不透明で密封されたパックを受け取りました。 患者とデータ収集者は盲目でした。 介入グループとプラセボ グループのバーは、食感、風味、香り、外観が類似していました。

1 か月後、すべての個人が新しい栄養評価のためにソロカバ大学に戻り、同じ二重盲検法 (T33) でより多くの食品バーと採血を受けました。 66 日 (T66) の終わりに、被験者は最後の採血と最終的な栄養評価のために戻ってきました。

生化学的分析 全コレステロール、ＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロール、トリグリセリド、およびグルコースを、市販のキットにより、メーカーの仕様に従って、自動化装置ＣＯＢＡＳ Ｃ１１１（Ｒｏｃｈｅ（登録商標））において、以下の方法に従って分析した。

コレステロールについては、10 μL のサンプルと 1.0 mL の酵素試薬を 37 ºC で 10 分間混合し、リポタンパク質リパーゼ酵素によって遊離コレステロールに完全に変換しました。 この反応には、コレステロールオキシダーゼ酵素による遊離コレステロールのコレステロール-3-オンおよびH2O2への酸化が含まれていました。 そして、4-アミノアンチピリンを含むフェノールに対するペルオキシダーゼの作用により、チェリー色原体が形成され、その色はコレステロールの濃度に比例します。

HDL を測定するために、血清をリンタングステン酸と塩化マグネシウムで処理しました。 そのため、10.000 rpm で 2 分間遠心分離した後、画分から LDL を沈殿させました。 上清に残った HDL は、コレステロールの方法論に従って実行されました。 HDL濃度は色に比例します。 LDL は、総コレステロールから HDL コレステロールを差し引いて計算されます。

血清トリグリセリドは、リポタンパク質リパーゼによってグリセロールと遊離脂肪酸に加水分解されました。 アデノシン三リン酸（ATP）とグリセロールキナーゼの存在下で、グリセロール-3-リン酸がリン酸化され、グリセロールリン酸オキシダーゼによってリン酸二水素アセトンとH2O2に酸化されました。 H2O2、4-アミノアンチピリン、および p-クロロフェノールは、赤色が形成されるまで、37 ºC の水浴中で 10 分間、ペルオキシダーゼによって上記で報告されたのと同じ反応プロセスを受けました。

血糖検査では、グルコン酸-6-リン酸中のNADPの存在下で、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼがグルコース-6-リン酸を酸化しました。 他の炭水化物は酸化されていません。 反応中のNADPH形成速度はグルコース濃度に正比例し、測光的に決定された。

酸化ストレス分析 還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の決定は、還元型総チオールベースの定量化によって行われた。 このために、150 μL の血液を 100 μL の 10% Triton X-100 および 100 μL の 30% TCA でボルテックスし、4000 rpm で 10 分間遠心分離しました。 キュベット 900 μL の 1M TFK、50 μL の上清、および 50 μL の 10 mM DTNB をピペッティングし、反応して黄色の複合体を形成しました。 測定値は分光光度計で 412 nm で取得されました。 濃度の計算には、定義済みの GSH 濃度 (0.005; 0.01; 0.025; 0.05; 0.1 mM) の検量線を使用しました。

カタラーゼ酵素の活性を評価するために、カタラーゼによるＨ ２ Ｏ ２ の分解に基づいて、２４０ｎｍでモニターした。 このために、血液を 50 mM TFK で 60 倍に希釈しました。 20 μL のアリコートを 1910 μL の同じ TFK と混合し、70 μL の H2O2 を加えて、モニターされた反応を 3 分間開始しました。 1 分あたりの変動定数 (κ) は、カタラーゼ酵素の発現 (κ/分) に役立ちました。

チオバルビツール酸反応性物質 (TBARS) は、脂質過酸化のバイオマーカーとして使用されました。 血漿アリコート (150 µL) を 50 µL NaOH および 50 µL Milli-Q 超純水 (Direct 8、Millipore®) と混合し、振盪しながら 60 °C で 30 分間インキュベートしました。 250 μL の 6% H3PO4、250 μL の 0.8% TBA、および 100 μL の 10% SDS をサンプルに加え、80 °C の浴に 1 時間入れました。 過酸化脂質は、酸性媒体中で TBA と反応してピンク色の化合物を形成し、分光光度計で 532 nm で読み取りました。 血漿中の TBARS の濃度を計算するために、主なチオバルビツール酸反応物質であるマロンジアルデヒドの検量線を作成しました (0.28; 0.56; 1.7; 3.4; 6.6 μM)。