Effecten van Lentinula Edodes-repen op dyslipidemie en oxidatieve stress bij cholesterolindividuen: gerandomiseerde studie

Onderzoeksopzet Het primaire resultaat van het onderzoek was cholesterolemie, zoals beoordeeld aan de hand van het totale cholesterolgehalte, triglyceriden of lipoproteïnen met lage dichtheid (LDL) en lipoproteïnen met hoge dichtheid (HDL). De secundaire uitkomsten omvatten bloedglucose, Body Mass Index (BMI) en biomarkers voor oxidatieve stress.

Van september 2018 tot december 2018 werd een prospectieve fase II, gerandomiseerde, dubbelblinde en placebogecontroleerde studie uitgevoerd. De studie is uitgevoerd aan de Universiteit van Sorocaba (UNISO), in de staat São Paulo, Brazilië. De studie werd goedgekeurd (Bijlage D) door Human Research Ethics Committee van de Universiteit van Sorocaba (protocolnummer 2.824.297), in overeenstemming met Resolutie 466/2012 van de National Health Council (BRASIL, 2012) en Research Ethics Review Committee (ERC) (WHO, 2016).

Werving van personen Voor de werving van personen werd vijf maanden voor de start van de fase II-studie met de bekendmaking begonnen. Het onderzoek is gepubliceerd op de website van de Universiteit van Sorocaba (UNISO), op sociale media en in folders verspreid over de campus met daarin een korte uitleg over het onderzoek, de in- en exclusiecriteria en de contactpersoon van de onderzoeker. Volgens resolutie 1.170 van Anvisa (National Health Surveillance Agency) zijn fase II-onderzoeken niet toegestaan ​​met minder dan 12 personen; het Agentschap stelt echter voor om minimaal 24 vrijwilligers te gebruiken.

Geschiktheidscriteria In totaal hebben 165 personen de online enquête van Google ingevuld.

• Inclusiecriteria Individuen van 20 tot 65 jaar oud, van beide geslachten, die ten minste één van de volgende biochemische markers op borderline-niveau hadden (totaal cholesterol 180 tot 239 mg/dL; LDL 130 tot 159 mg/dL; triglyceriden van 150 tot 200 mg / dL), werden gerekruteerd, gediagnosticeerd door biochemische onderzoeken met recente data op de dag van rekrutering. Ze zijn tolerant ten opzichte van ingrediënten van repen en shiitake. Beschikbaarheid om de datum en tijd van de bloedafname bij te wonen.
• Uitsluitingscriteria Sommigen van hen hadden echter ziekten zoals onder andere kanker, hartaandoeningen, neurodegeneratieve ziekten en diabetes. Deze ziekten konden worden beschouwd als confounders van de studie en sommige gerekruteerde mensen moesten worden uitgesloten. Zwangere vrouwen, vrouwen die borstvoeding geven of hormoonvervangende vrouwen konden ook niet deelnemen.

Individuen werden geïnstrueerd om hun eetgewoonten en -patronen, fysieke activiteitsniveau of gebruik van orale anticonceptiva tijdens het onderzoek niet te veranderen, waardoor alleen de effecten van Shiitake toegevoegd aan het dieet voor elk individu op de blootgestelde groep werden geïdentificeerd.

Interventies bestuderen. De studie ging officieel van start met 68 personen, die een geïnformeerde toestemmingsverklaring ondertekenden. In de eerste (Tijd 0 - T0), in de tweede (Tijd 33 dagen - T33) en in de derde (Tijd 66 dagen - T66) bijeenkomsten werden de proefpersonen onderworpen aan voedingsevaluatie en anamnese, 24-uurs herinnering aan eetgewoonten en eetfrequentie.

In de eerste maand van het onderzoek werden 4.100 placebo- of paddenstoelenrepen geproduceerd en in de tweede maand bedroeg de productie 3.500 repen. Volgens de Grotto en medewerkers (2015) hebben ze een studie uitgevoerd waarin verschillende shiitake-concentraties (100, 400 en 800 mg/kg/dag) werden geëvalueerd om de mate van toxiciteit bij dieren te bepalen. Shiitake-concentratie van 100 mg / kg / dag is veilig gebleken. Bovendien werd de Shiitake-snoepjesformulering goedgekeurd in de sensorische analyse en koopintentie in de vorige studie.

Randomisatie De personen (68) werden willekeurig toegewezen (met behulp van een tabel met willekeurige getallen) in 2 groepen: I - Placebogroep (n = 32) en II - Interventiegroep (n = 36). Om de aanbevolen dagelijkse inname van Shiitake van 100 mg/kg/dag te garanderen, werd elke deelnemer gewogen om het aantal repen dat per dag werd geconsumeerd te bepalen.

De personen ontvingen na voedingsevaluatie en bloedafname een niet-geïdentificeerde, ondoorzichtige en verzegelde verpakking met individuele vacuümstaven voor een periode van T33 dagen. De patiënten en de gegevensverzamelaar waren blind. De repen van de interventie- en placebogroepen waren vergelijkbaar qua textuur, smaak, aroma en uiterlijk.

Na een maand keerden alle individuen terug naar de Universiteit van Sorocaba voor nieuwe voedingsbeoordelingen, waarbij ze meer voedselrepen en bloedafname kregen met dezelfde dubbelblinde zorg (T33). Aan het einde van zesenzestig dagen (T66) keerden de proefpersonen terug voor de laatste bloedafname en definitieve voedingsbeoordeling.

Biochemische analyse Totaal cholesterol, LDL-cholesterol, HDL-cholesterol, triglyceriden en glucose werden geanalyseerd door commerciële kits, volgens de specificaties van de fabrikant, in de geautomatiseerde apparatuur COBAS C111 (Roche®) volgens de onderstaande methodologieën.

Voor cholesterol werden 10 μl monster en 1,0 ml enzymreagens gedurende 10 minuten bij 37 ° C gemengd voor totale transformatie in vrij cholesterol, door lipoproteïnelipase-enzym. De reactie omvatte de oxidatie van vrij cholesterol tot cholesterol-3-on en H2O2 door het cholesteroloxidase-enzym. En met de werking van peroxidase op fenol met 4-aminoantipyrine vormde een kersenchromogeen, waarvan de kleur evenredig is met de cholesterolconcentratie.

Voor de bepaling van HDL werd het serum behandeld met fosfowolframaatzuur en magnesiumchloride. Het LDL werd dus uit de fractie geprecipiteerd na 2 minuten centrifugeren bij 10.000 rpm. HDL, dat achterbleef in het supernatant, werd uitgevoerd volgens de cholesterolmethodologie. HDL-concentratie is evenredig met de kleur. LDL werd berekend door HDL-cholesterol af te trekken van het totale cholesterol.

Serumtriglyceriden werden gehydrolyseerd tot glycerol en vrij vetzuur door lipoproteïnelipase. In aanwezigheid van adenosinetrifosfaat (ATP) en glycerolkinase werd glycerol-3-fosfaat gefosforyleerd, dat werd geoxideerd tot acetondiwaterstoffosfaat en H2O2 door de glycerolfosfaatoxidase. H2O2, 4-aminoantipyrine en p-chloorfenol ondergingen hetzelfde reactieproces als hierboven gerapporteerd door peroxidase in een waterbad van 37 ºC gedurende 10 minuten tot de vorming van een rode kleur.

Voor de bloedglucosetest oxideerde glucose-6-fosfaatdehydrogenase glucose-6-fosfaat in aanwezigheid van NADP in gluconaat-6-fosfaat. Er zijn geen andere koolhydraten geoxideerd. De snelheid van NADPH-vorming tijdens de reactie was direct evenredig met de glucoseconcentratie, die fotometrisch werd bepaald.

Oxidatieve stressanalyse De bepaling van gereduceerd glutathion (GSH) werd gedaan door kwantificering van gereduceerde totale thiolen. Hiervoor werd 150 µL van het bloed gevortext met 100 µL 10% Triton X-100 en 100 µL 30% TCA, en vervolgens gedurende 10 minuten bij 4000 rpm gecentrifugeerd. In de cuvet werden 900 µl 1M TFK, 50 µl supernatant en 50 µl 10 mM DTNB gepipetteerd, die reageerden en een geel complex vormden. De aflezing werd gedaan bij 412 nm in een spectrofotometer. Voor de berekening van de concentratie werd de kalibratiecurve met vooraf gedefinieerde GSH-concentraties (0,005; 0,01; 0,025; 0,05; 0,1 mM) gebruikt.

Om de activiteit van het katalase te evalueren werd enzym gebruikt, gebaseerd op de ontleding van H2O2 door katalase, gevolgd bij 240 nm. Hiervoor werd het bloed 60 keer verdund in 50 mM TFK. Een aliquot van 20 μl werd gemengd met 1910 μl van dezelfde TFK en 70 μl H2O2 werd toegevoegd, waardoor de gecontroleerde reactie gedurende drie minuten op gang kwam. Een variatieconstante (K) per minuut hielp bij de expressie van het katalase-enzym (K/min).

Thiobarbituurzuur-reactieve stoffen (TBARS) werden gebruikt als biomarker voor lipideperoxidatie. Monsters van plasma (150 µl) werden gemengd met 50 µl NaOH en 50 µl Milli-Q ultrapuur water (Direct 8, Millipore®) en gedurende 30 minuten onder schudden bij 60°C geïncubeerd. 250 µl 6% H3P04, 250 µl 0,8% TBA en 100 µl 10% SDS werden aan de monsters toegevoegd en gedurende één uur in het bad van 80°C gebracht. Lipideperoxiden reageerden met TBA in zuur medium om een ​​roze verbinding te vormen en af ​​te lezen in een spectrofotometer bij 532 nm. Om de concentratie van TBARS in plasma te berekenen, werd een kalibratiecurve van malondialdehyde, de belangrijkste thiobarbituurzuur-reactieve stof, gemaakt (0,28; 0,56; 1,7; 3,4; 6,6 µM).