Lentinula Edodes Barsin vaikutukset dyslipidemiaan ja oksidatiiviseen stressiin kolesterolihenkilöillä: satunnaistettu tutkimus

Tutkimuksen suunnittelu Tutkimuksen ensisijainen tulos oli kolesterolikemia, joka arvioitiin kokonaiskolesterolitasoilla, triglyserideillä tai matalatiheyksisten lipoproteiinien (LDL) ja korkean tiheyden lipoproteiinien (HDL) perusteella. Toissijaisia ​​tuloksia olivat verensokeri, kehon massaindeksi (BMI) ja oksidatiivisen stressin biomarkkerit.

Tuleva vaihe II, satunnaistettu, kaksoissokkoutettu ja lumekontrolloitu tutkimus suoritettiin syyskuusta 2018 joulukuuhun 2018. Tutkimus suoritettiin Sorocaban yliopistossa (UNISO), São Paulon osavaltiossa, Brasiliassa. Tutkimuksen hyväksyi (liite D) Sorocaban yliopiston Human Research Ethics Committee (pöytäkirjanumero 2.824.297) National Health Councilin (BRASIL, 2012) ja Research Ethics Review Committeen (ERC) päätöslauselman 466/2012 mukaisesti. (WHO, 2016).

Henkilöiden rekrytointi Henkilöiden rekrytointia varten julkistaminen aloitettiin viisi kuukautta ennen vaiheen II kokeen alkamista. Tutkimus julkaistiin Sorocaban yliopiston (UNISO) verkkosivuilla, sosiaalisessa mediassa ja koko kampuksella jaetuissa kansioissa, joissa oli lyhyt selvitys tutkimuksesta, mukaanlukien ja poissulkemiskriteereistä sekä tutkijan yhteystiedot. Anvisan (Kansallinen terveydenhuoltovirasto) päätöslauselman 1.170 mukaan vaiheen II tutkimukset eivät ole sallittuja alle 12 henkilön kanssa; Virasto ehdottaa kuitenkin vähintään 24 vapaaehtoisen käyttämistä.

Kelpoisuusehdot Googlen verkkokyselyyn vastasi yhteensä 165 henkilöä.

• Osallistumiskriteerit 20–65-vuotiaat, molemmista sukupuolista olevat henkilöt, joilla oli vähintään yksi seuraavista biokemiallisista markkereista rajatasolla (kokonaiskolesteroli 180–239 mg/dl; LDL 130–159 mg/dl; triglyseridit 150 200 mg/dl), rekrytoitiin ja diagnosoitiin biokemiallisilla kokeilla, joiden päivämäärät ovat viimeaikaiset rekrytointipäivään. Ole suvaitsevainen patukan ainesosille ja shiitakelle. Mahdollisuus osallistua verenkeräyksen päivämäärään ja kellonaikaan.
• Poissulkemiskriteerit Joillakin heistä oli kuitenkin sairauksia, kuten syöpä, sydänsairaus, hermostoa rappeuttava sairaus ja diabetes. Näitä sairauksia voitiin pitää tutkimuksen hämmennystekijöinä, ja jotkut värvätyt ihmiset jouduttiin sulkemaan pois. Myöskään raskaana olevat, imettävät tai hormonikorvausnaiset eivät voineet osallistua.

Henkilöitä opastettiin olemaan muuttamatta ruokailutottumuksiaan ja -tottumuksiaan, fyysistä aktiivisuuttaan tai suun kautta otettavaa ehkäisyä tutkimuksen aikana, jolloin tunnistettiin vain ruokavalioon lisätyn shiitaken vaikutukset jokaiselle altistuneelle ryhmälle.

Tutkimusinterventiot. Tutkimus alkoi virallisesti 68 henkilöllä, jotka allekirjoittivat tietoisen suostumuksen. Ensimmäisessä (aika 0 - T0), toisessa (aika 33 päivää - T33) ja kolmannessa (aika 66 päivää - T66) kokouksessa koehenkilöille suoritettiin ravitsemusarviointi ja anamneesi, ruokailutottumusten 24 tunnin muisteleminen. ja ruokailutiheys.

Tutkimuksen ensimmäisenä kuukautena valmistettiin 4 100 lume- tai sienipatukkaa ja toisena kuukautena 3 500 patukkaa. Grotto ja yhteistyökumppanien (2015) mukaan suoritti tutkimuksen, jossa arvioitiin erilaisia ​​Shiitake-pitoisuuksia (100, 400 ja 800 mg/kg/vrk) myrkyllisyyden määrittämiseksi eläimillä. Shiitake-pitoisuuden 100 mg/kg/vrk on osoitettu olevan turvallinen. Lisäksi Shiitake-makeapatukkaformulaatio hyväksyttiin aistinvaraisessa analyysissä ja ostoaikeissa edellisessä tutkimuksessa.

Satunnaistaminen Yksilöt (68) jaettiin satunnaisesti (satunnaislukutaulukon avulla) kahteen ryhmään: I - Lumeryhmä (n = 32) ja II - Interventioryhmä (n = 36). Jotta varmistetaan shiitaken suositeltu päivittäinen saanti 100 mg/kg/vrk, jokainen osallistuja painotettiin määrittämään päivässä kulutettujen patukkaiden lukumäärä.

Henkilöt saivat ravitsemusarvioinnin ja verenkeräyksen jälkeen tunnistamattoman läpinäkymättömän ja suljetun pakatun, joka sisälsi yksittäin tyhjiötangot T33 päivän ajaksi. Potilaat ja tiedonkeruu olivat sokeita. Interventio- ja lumeryhmien patukat olivat rakenteeltaan, maultaan, aromiltaan ja ulkonäöltään samanlaisia.

Kuukauden kuluttua kaikki henkilöt palasivat Sorocaban yliopistoon uusiin ravitsemusarviointiin, ja he saivat lisää ruokapatukoita ja verinäytteitä samalla kaksoissokkohoidolla (T33). Kuusikymmentäkuusi päivän (T66) lopussa koehenkilöt palasivat viimeistä verenottoa ja lopullista ravitsemusarviointia varten.

Biokemiallinen analyysi Kokonaiskolesteroli, LDL-kolesteroli, HDL-kolesteroli, triglyseridit ja glukoosi analysoitiin kaupallisilla sarjoilla valmistajan ohjeiden mukaisesti automaattisessa laitteistossa COBAS C111 (Roche®) alla olevien menetelmien mukaisesti.

Kolesterolia varten 10 µl näytettä ja 1,0 ml entsyymireagenssia sekoitettiin 37 ºC:ssa 10 minuutin ajan, jotta se muuttui kokonaan vapaaksi kolesteroliksi lipoproteiinilipaasientsyymin avulla. Reaktiossa vapaa kolesteroli hapettui kolesteroli-3-oniksi ja H2O2:ksi kolesterolin oksidaasientsyymin vaikutuksesta. Ja peroksidaasin vaikutuksesta fenoliin 4-aminoantipyriinin kanssa muodostui kirsikkakromogeeni, jonka väri oli verrannollinen kolesterolin pitoisuuteen.

HDL:n määritystä varten seerumia käsiteltiin fosfotungstaattihapolla ja magnesiumkloridilla. Niinpä LDL saostui fraktiosta 2 minuutin sentrifugoinnin jälkeen 10 000 rpm:llä. HDL, joka jäi supernatanttiin, suoritettiin kolesterolimetodologian mukaisesti. HDL-pitoisuus on verrannollinen väriin. LDL laskettiin vähentämällä HDL-kolesteroli kokonaiskolesterolista.

Seerumin triglyseridit hydrolysoitiin glyseroliksi ja vapaaksi rasvahapoksi lipoproteiinilipaasin vaikutuksesta. Adenosiinitrifosfaatin (ATP) ja glyserolikinaasin läsnäollessa glyseroli-3-fosfaatti fosforyloitui, joka hapetettiin asetonidivetyfosfaatiksi ja H202:ksi glyserolifosfaattioksidaasilla. H2O2:lle, 4-aminoantipyriinille ja p-kloorifenolille tehtiin sama reaktioprosessi kuin edellä kerrottiin peroksidaasilla 37 ºC vesihauteessa 10 minuutin ajan, kunnes muodostui punainen väri.

Verensokerin mittausta varten glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasi hapetti glukoosi-6-fosfaattia NADP:n läsnä ollessa glukonaatti-6-fosfaatissa. Muita hiilihydraatteja ei ole hapettunut. NADPH:n muodostumisnopeus reaktion aikana oli suoraan verrannollinen glukoosipitoisuuteen, joka määritettiin fotometrisesti.

Oksidatiivinen stressianalyysi Pelkistyneen glutationin (GSH) määritys tehtiin kvantifioimalla pelkistettyjen tiolien kokonaismäärä perustuen. Tätä varten 150 ui verta vorteksoitiin 100 ul:lla 10 % Triton X-100:a ja 100 ul:lla 30 % TCA:ta, sitten sentrifugoitiin 10 minuuttia nopeudella 4 000 rpm. Kyvettiin pipetoitiin 900 ui 1 M TFK:ta, 50 ui supernatanttia ja 50 ui 10 mM DTNB:tä, jotka reagoivat muodostaen keltaisen kompleksin. Lukema otettiin 412 nm:ssä spektrofotometrillä. Pitoisuuden laskemiseen käytettiin kalibrointikäyrää ennalta määrätyillä GSH-pitoisuuksilla (0,005; 0,01; 0,025; 0,05; 0,1 mM).

Katalaasientsyymin aktiivisuuden arvioimiseen käytettiin katalaasin aiheuttaman H202:n hajoamisen perusteella, jota seurattiin aallonpituudella 240 nm. Tätä varten veri laimennettiin 60 kertaa 50 mM TFK:ssa. 20 µl:n alikvootti sekoitettiin 1910 µl:aan samaa TFK:ta ja lisättiin 70 µl H2O2:ta, mikä aloitti valvotun reaktion kolmen minuutin ajan. Vaihteluvakio (κ) minuutissa auttoi katalaasientsyymin ilmentymisessä (κ/min).

Tiobarbituurihapporeaktiivisia aineita (TBARS) käytettiin lipidiperoksidaation biomarkkerina. Plasman alikvootit (150 ui) sekoitettiin 50 ui:aan NaOH:ta ja 50 ui:aan Milli-Q ultrapuhdasta vettä (Direct 8, Millipore®) ja inkuboitiin 60 °C:ssa 30 minuuttia ravistellen. 250 ui 6 % H3PO4:a, 250 ui 0,8 % TBA:ta ja 100 ui 10 % SDS:ää lisättiin näytteisiin ja vietiin 80 °C:seen hauteeseen yhdeksi tunniksi. Lipidiperoksidit reagoivat TBA:n kanssa happamassa väliaineessa muodostaen vaaleanpunaisen yhdisteen ja luettiin spektrofotometrillä 532 nm:ssä. Plasman TBARS-pitoisuuden laskemiseksi tehtiin malondialdehydin, pääasiallisen tiobarbituurihapon reaktiivisen aineen, kalibrointikäyrä (0,28; 0,56; 1,7; 3,4; 6,6 uM).