Effekter af Lentinula Edodes Bars på dyslipidæmi og oxidativ stress hos kolesterolindivider: Randomiseret undersøgelse

Undersøgelsesdesign Det primære resultat af undersøgelsen var kolesterolæmi, som vurderet ved totale kolesterolniveauer, triglycerider eller low-density lipoproteins (LDL) og high-density lipoproteins (HDL). De sekundære resultater omfattede blodsukker, kropsmasseindeks (BMI) og biomarkører for oxidativ stress.

Et prospektivt fase II, randomiseret, dobbeltblindt og placebokontrolleret forsøg blev udført fra september 2018 til december 2018. Undersøgelsen er udført ved University of Sorocaba (UNISO), São Paulo State, Brasilien. Undersøgelsen blev godkendt (bilag D) af Human Research Ethics Committee fra University of Sorocaba (protokolnummer 2.824.297), i overensstemmelse med resolution 466/2012 fra National Health Council (BRASIL, 2012) og Research Ethics Review Committee (ERC) (WHO, 2016).

Rekruttering af individer Til rekruttering af individer blev offentliggørelsen påbegyndt fem måneder før starten af ​​fase II-studiet. Forskningen blev offentliggjort på webstedet for University of Sorocaba (UNISO), på sociale medier og mapper fordelt på hele campus med en kort forklaring om forskningen, inklusions- og eksklusionskriterier og forskerens kontakt. Ifølge resolution 1.170 fra Anvisa (National Health Surveillance Agency) er fase II-studier ikke tilladt med mindre end 12 personer; agenturet foreslår dog at bruge mindst 24 frivillige.

Kvalifikationskriterier I alt 165 personer gennemførte Googles onlineundersøgelse.

• Inklusionskriterier Individer i alderen fra 20 til 65 år, af begge køn, som havde mindst én af følgende biokemiske markører på grænseniveauet (total kolesterol 180 til 239 mg/dL; LDL 130 til 159 mg/dL; triglycerider på 150 til 200 mg/dL), blev rekrutteret, diagnosticeret ved biokemiske undersøgelser med datoer, der er nyere end rekrutteringsdagen. Vær tolerant over for bars ingredienser og shiitake. Mulighed for at deltage på dato og tidspunkt for blodopsamling.
• Eksklusionskriterier Nogle af dem havde dog sygdomme som kræft, hjertesygdomme, neurodegenerative sygdomme, diabetes, blandt andre. Disse sygdomme kunne betragtes som konfoundere af undersøgelsen, og nogle rekrutterede personer måtte udelukkes. Gravide, ammende eller hormonsubstituerende kvinder kunne heller ikke deltage.

Individer blev instrueret om ikke at ændre deres spisevaner og mønstre, fysisk aktivitetsniveau eller brug af orale præventionsmidler under undersøgelsen, og dermed identificerede kun virkningerne af Shiitake tilsat kosten for hver enkelt person på den eksponerede gruppe.

Studieinterventioner. Undersøgelsen startede officielt med 68 personer, som underskrev en informeret samtykkeerklæring. I det første (Tid 0 - T0), i det andet (Tid 33 dage - T33) og i det tredje (Tid 66 dage - T66) møder blev forsøgspersonerne underkastet ernæringsvurdering og anamnese, 24-timers tilbagekaldelse af spisevaner og spisefrekvens.

I den første måned af undersøgelsen blev der produceret 4.100 placebo- eller svampebarer, og i den anden måned var produktionen 3.500 barer. Ifølge Grotten og samarbejdspartnere (2015), gennemførte en undersøgelse, der evaluerede forskellige Shiitake-koncentrationer (100, 400 og 800 mg/Kg/dag) for at bestemme graden af ​​toksicitet hos dyr. Shiitake-koncentration på 100 mg/kg/dag har vist sig at være sikker. Desuden blev Shiitake søde bar-formuleringen godkendt i den sensoriske analyse og købsintention i den tidligere undersøgelse.

Randomisering Individerne (68) blev tilfældigt fordelt (ved hjælp af en tabel med tilfældige tal) i 2 grupper: I - Placebogruppe (n = 32) og II - Interventionsgruppe (n = 36). For at sikre det daglige anbefalede indtag af Shiitake på 100 mg/Kg/dag, blev hver deltager vægtet for at bestemme antallet af forbrugte barer pr. dag.

Individerne modtog efter ernæringsvurdering og blodindsamling en uidentificeret uigennemsigtig og forseglet pakket indeholdende individuelle vakuumstænger i en periode på T33 dage. Patienterne og dataindsamleren var blinde. Stængerne i interventions- og placebogruppen var ens i tekstur, smag, aroma og udseende.

Efter en måned vendte alle individer tilbage til University of Sorocaba for nye ernæringsvurderinger, hvor de modtog flere madbarer og blodprøvetagning med den samme dobbeltblindede pleje (T33). Ved slutningen af ​​seksogtres dage (T66) vendte forsøgspersonerne tilbage til den sidste blodopsamling og endelige ernæringsvurdering.

Biokemisk analyse Totalkolesterol, LDL-kolesterol, HDL-kolesterol, triglycerider og glucose blev analyseret med kommercielle kits, efter producentens specifikationer, i det automatiserede udstyr COBAS C111 (Roche®) i overensstemmelse med nedenstående metoder.

For kolesterol blev 10 µL prøve og 1,0 ml enzymreagens blandet ved 37 ºC i 10 minutter til total transformation til frit kolesterol ved hjælp af lipoproteinlipaseenzym. Reaktionen involverede oxidation af frit kolesterol til cholesterol-3-on og H2O2 af cholesteroloxidase-enzymet. Og med virkningen af ​​peroxidase på phenol med 4-aminoantipyrin dannede et kirsebærchromogen, farven er proportional med koncentrationen af ​​kolesterol.

Til bestemmelse af HDL blev serummet behandlet med phosphowolframatsyre og magnesiumchlorid. Så LDL blev udfældet fra fraktionen efter centrifugering i 2 minutter ved 10.000 rpm. HDL, som forblev i supernatanten, blev udført i overensstemmelse med kolesterolmetodologien. HDL-koncentrationen er proportional med farven. LDL blev beregnet ved at trække HDL-kolesterol fra totalt kolesterol.

Serumtriglycerider blev hydrolyseret til glycerol og fri fedtsyre med lipoproteinlipase. I nærvær af adenosintriphosphat (ATP) og glycerolkinase blev glycerol-3-phosphat phosphoryleret, som blev oxideret til acetonedihydrogenphosphat og H2O2 af glycerolphosphatoxidasen. H2O2, 4-aminoantipyrin og p-chlorphenol gennemgik den samme reaktionsproces beskrevet ovenfor med peroxidase i et 37 ºC vandbad i 10 minutter indtil dannelse af rød farve.

Til blodsukkertesten oxiderede glucose-6-phosphat-dehydrogenase glucose-6-phosphat i nærværelse af NADP i gluconat-6-phosphat. Ingen andre kulhydrater er blevet oxideret. Hastigheden af ​​NADPH-dannelse under reaktionen var direkte proportional med glucosekoncentrationen, idet den blev bestemt fotometrisk.

Oxidativ stress-analyse Bestemmelsen af ​​reduceret glutathion (GSH) blev foretaget ved kvantificering af reducerede totale thioler baseret. Til dette blev 150 µL af blodet vortexet med 100 µL 10 % Triton X-100 og 100 µL 30 % TCA, derefter centrifugeret i 10 minutter ved 4000 rpm. I kuvetten blev 900 µL 1 M TFK, 50 µL supernatant og 50 µL 10 mM DTNB pipetteret, som reagerede til dannelse af et gult kompleks. Aflæsningen blev taget ved 412 nm i et spektrofotometer. Til beregning af koncentrationen blev kalibreringskurven med foruddefinerede GSH-koncentrationer (0,005; 0,01; 0,025; 0,05; 0,1 mM) anvendt.

Til at evaluere aktiviteten af ​​katalase-enzymet blev anvendt, baseret på nedbrydning af H2O2 ved katalase, overvåget ved 240 nm. Til dette blev blodet fortyndet 60 gange i 50 mM TFK. En alikvot på 20 μL blev blandet til 1910 μL af den samme TFK, og 70 μL H2O2 blev tilsat, hvilket initierede den overvågede reaktion i tre minutter. En variationskonstant (κ) pr. minut hjalp med ekspressionen af ​​katalaseenzym (κ/min).

Thiobarbitursyrereaktive stoffer (TBARS) blev brugt som en biomarkør for lipidperoxidation. Plasmaalikvoter (150 µL) blev blandet med 50 µL NaOH og 50 µL Milli-Q ultrarent vand (Direct 8, Millipore®) og inkuberet ved 60 °C i 30 minutter under omrystning. 250 µL 6 % H3PO4, 250 µL 0,8 % TBA og 100 µL 10 % SDS blev tilsat til prøverne og taget til 80 °C-badet i en time. Lipidperoxider reagerede med TBA i surt medium til dannelse af en lyserød forbindelse og aflæst i et spektrofotometer ved 532 nm. For at beregne koncentrationen af ​​TBARS i plasma blev der lavet en kalibreringskurve for malondialdehyd, det vigtigste thiobarbitursyre-reaktive stof (0,28; 0,56; 1,7; 3,4; 6,6 µM).