A Lentinula Edodes Bars hatása a diszlipidémiára és az oxidatív stresszre koleszterinszintű egyéneknél: Randomizált vizsgálat

A vizsgálat tervezése A vizsgálat elsődleges eredménye a koleszterinszint volt, amelyet az összkoleszterinszint, a trigliceridek vagy az alacsony sűrűségű lipoproteinek (LDL) és a nagy sűrűségű lipoproteinek (HDL) alapján értékeltek. A másodlagos eredmények között szerepelt a vércukorszint, a testtömegindex (BMI) és az oxidatív stressz biomarkerei.

Egy prospektív II. fázisú, randomizált, kettős vak és placebo-kontrollos vizsgálatot végeztek 2018 szeptembere és 2018 decembere között. A tanulmány a Sorocaba Egyetemen (UNISO), São Paulo államban, Brazíliában készült. A tanulmányt a Sorocaba Egyetem Humán Kutatási Etikai Bizottsága (2.824.297 protokollszám) hagyta jóvá (D melléklet) a Nemzeti Egészségügyi Tanács (BRASIL, 2012) és a Kutatásetikai Felülvizsgálati Bizottság (ERC) 466/2012. számú határozatával összhangban. (WHO, 2016).

Magánszemélyek toborzása A magánszemélyek toborzása esetében a nyilvánosságra hozatalt öt hónappal a II. fázisú vizsgálat megkezdése előtt kezdeményezték. A kutatás a Sorocaba Egyetem (UNISO) honlapján, a közösségi médiában és az egész campuson terjesztett mappákban jelent meg, amelyek rövid magyarázatot tartalmaznak a kutatásról, a befogadási és kizárási kritériumokról, valamint a kutató kapcsolattartásáról. Az Anvisa (Országos Egészségügyi Felügyeleti Ügynökség) 1.170. számú határozata szerint a II. fázisú vizsgálatok nem megengedettek 12 főnél kevesebbel; az Ügynökség azonban legalább 24 önkéntes alkalmazását javasolja.

Alkalmassági feltételek Összesen 165 személy töltötte ki a Google online felmérését.

• Bevonási kritériumok 20 és 65 év közötti, mindkét nemű egyének, akiknél a következő biokémiai markerek közül legalább egy határértéken volt (összes koleszterin 180-239 mg/dl; LDL 130-159 mg/dl; trigliceridek 150 200 mg/dL-ig) vették fel, és biokémiai vizsgálatokkal diagnosztizálták a felvétel napjáig tartó dátummal. Legyen toleráns a szeletek összetevőivel és a shiitake-val szemben. Rendelkezésre állás a vérvétel dátumán és időpontjában.
• Kizárási kritériumok Néhányuknak azonban voltak olyan betegségei, mint a rák, szívbetegség, neurodegeneratív betegség, cukorbetegség stb. Ezek a betegségek a vizsgálat megzavaró tényezőinek tekinthetők, és néhány toborzott személyt ki kellett zárni. Terhes, szoptató vagy hormonpótló nők sem vehettek részt.

Az egyéneket arra utasították, hogy a vizsgálat során ne változtassanak étkezési szokásaikon és szokásaikon, a fizikai aktivitási szintjükön vagy az orális fogamzásgátlók használatán, így csak a diétához adott Shiitake hatásait lehetett azonosítani minden egyes egyén esetében a kitett csoportban.

Tanulmányozási beavatkozások. A tanulmány hivatalosan 68 személlyel indult, akik beleegyező nyilatkozatot írtak alá. Az első (Időpont 0 - T0), a második (Idő 33 nap - T33) és a harmadik (Idő 66 nap - T66) találkozón az alanyokat táplálkozási értékelésnek és anamnézisnek, az étkezési szokások 24 órás felidézésének vetették alá. és étkezési gyakoriság.

A vizsgálat első hónapjában 4100 placebót vagy gombaszeletet, a második hónapban pedig 3500 rudat gyártottak. A Grotto és munkatársai (2015) szerint tanulmányt végzett a Shiitake különböző koncentrációinak (100, 400 és 800 mg/kg/nap) értékelésével, hogy meghatározza a toxicitás mértékét állatokon. A 100 mg/kg/nap Shiitake koncentráció biztonságosnak bizonyult. Emellett a Shiitake édesszelet készítményt az érzékszervi elemzésben és a vásárlási szándékban jóváhagyták az előző vizsgálatban.

Randomizálás Az egyéneket (68) véletlenszerűen (véletlenszámok táblázata segítségével) 2 csoportba osztották: I - Placebo csoport (n = 32) és II - Beavatkozó csoport (n = 36). A napi ajánlott shiitake 100 mg/kg/nap bevitel biztosítása érdekében minden résztvevőt súlyoztunk, hogy meghatározzuk a naponta elfogyasztott rudak számát.

Az egyének a táplálkozási értékelés és a vérvétel után egy azonosítatlan átlátszatlan és lezárt csomagot kaptak, amely egyedileg vákuumrudakat tartalmazott, 33 napig. A betegek és az adatgyűjtő vakok voltak. Az intervenciós és a placebo-csoport rúdjai hasonlóak voltak szerkezetükben, ízükben, aromájukban és megjelenésükben.

Egy hónap elteltével minden egyén visszatért a Sorocaba Egyetemre új táplálkozási értékelésre, ahol több ételszeletet és vérvételt kaptak ugyanazzal a kettős vak ellátással (T33). A hatvanhat nap végén (T66) az alanyok visszatértek az utolsó vérvételre és a végső táplálkozási értékelésre.

Biokémiai elemzés Az összkoleszterint, LDL-koleszterint, HDL-koleszterint, triglicerideket és glükózt kereskedelmi készletekkel elemeztük, a gyártó előírásait követve, COBAS C111 (Roche®) automata berendezésben, az alábbi módszerek szerint.

A koleszterin esetében 10 µl mintát és 1,0 ml enzimreagenst kevertünk össze 37 ºC-on 10 percig, hogy a lipoprotein lipáz enzim segítségével a teljes szabad koleszterinné alakuljon át. A reakció során a szabad koleszterint koleszterin-3-onná és H2O2-vé oxidálták a koleszterin-oxidáz enzim által. És a fenol peroxidáz hatására 4-amino-antipirinnel cseresznye kromogén keletkezett, amelynek színe arányos a koleszterin koncentrációjával.

A HDL meghatározásához a szérumot foszfor-volframátsavval és magnézium-kloriddal kezeltük. Így az LDL kicsapódott a frakcióból 2 perces centrifugálás után 10 000 fordulat/perc mellett. A felülúszóban maradt HDL-t koleszterin módszertan szerint végeztük. A HDL koncentráció arányos a színnel. Az LDL-t úgy számítottuk ki, hogy a HDL-koleszterint kivontuk az összkoleszterinből.

A szérum triglicerideket lipoprotein lipáz glicerinné és szabad zsírsavvá hidrolizálta. Adenozin-trifoszfát (ATP) és glicerin-kináz jelenlétében a glicerin-3-foszfát foszforilálódott, amelyet a glicerin-foszfát-oxidáz aceton-dihidrogén-foszfáttá és H2O2-vé oxidált. A H2O2, a 4-amino-antipirin és a p-klór-fenol ugyanazon a reakciófolyamaton ment keresztül, amelyet a fentiekben leírtunk, peroxidázzal 37 ºC-os vízfürdőben 10 percig, amíg vörös szín nem alakult ki.

A vércukorszint-teszthez a glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz oxidálta a glükóz-6-foszfátot NADP jelenlétében glükonát-6-foszfátban. Más szénhidrátok nem oxidálódnak. A reakció során a NADPH képződés sebessége egyenesen arányos a glükózkoncentrációval, amelyet fotometriával határoztunk meg.

Oxidatív stresszelemzés A redukált glutation (GSH) meghatározását a redukált összes tiol mennyiségi meghatározásával végeztük. Ehhez 150 µl vért vortexeltünk 100 µl 10%-os Triton X-100-zal és 100 µl 30%-os TCA-val, majd 10 percig 4000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk. A küvettába 900 µl 1 M TFK-t, 50 µl felülúszót és 50 µl 10 mM DTNB-t pipettáztunk, amelyek reakcióba lépve sárga komplexet képeztek. A leolvasást 412 nm-en végeztük spektrofotométerrel. A koncentráció kiszámításához a kalibrációs görbét használtuk előre meghatározott GSH koncentrációkkal (0,005; 0,01; 0,025; 0,05; 0,1 mM).

A kataláz enzim aktivitásának értékelésére a H2O2 kataláz általi lebontását alkalmaztuk, 240 nm-en követve. Ehhez a vért 60-szorosára hígítottuk 50 mM TFK-ban. Egy 20 μl-es alikvot részt kevertünk 1910 µl azonos TFK-hoz, és 70 µl H2O2-t adtunk hozzá, elindítva a megfigyelt reakciót három percig. A percenkénti változási állandó (κ) segített a kataláz enzim expressziójában (κ/perc).

A lipidperoxidáció biomarkereként tiobarbitursavval reaktív anyagokat (TBARS) használtak. A plazma alikvot részeket (150 µl) összekevertük 50 µl NaOH-val és 50 µl Milli-Q ultratiszta vízzel (Direct 8, Millipore®), és 60 °C-on 30 percig rázatással inkubáltuk. 250 µl 6%-os H3PO4-et, 250 µl 0,8%-os TBA-t és 100 ul 10%-os SDS-t adtunk a mintákhoz, és egy órára 80 °C-os fürdőbe vittük. A lipid-peroxidok savas közegben TBA-val reagálva rózsaszínű vegyületet képeztek, és spektrofotométerrel 532 nm-en olvasták le. A TBARS plazmakoncentrációjának kiszámításához a malondialdehid, a fő tiobarbitursav reakcióképes anyag kalibrációs görbéjét készítettük el (0,28; 0,56; 1,7; 3,4; 6,6 µM).