Wpływ batonów Lentinula Edodes na dyslipidemię i stres oksydacyjny u osób z cholesterolem: badanie randomizowane

Projekt badania Głównym wynikiem badania była cholesterolemia, oceniana na podstawie poziomów cholesterolu całkowitego, trójglicerydów lub lipoprotein o małej gęstości (LDL) i lipoprotein o dużej gęstości (HDL). Drugorzędne wyniki obejmowały poziom glukozy we krwi, wskaźnik masy ciała (BMI) i biomarkery stresu oksydacyjnego.

Prospektywne, randomizowane, podwójnie ślepe i kontrolowane placebo badanie fazy II przeprowadzono od września 2018 r. do grudnia 2018 r. Badanie przeprowadzone na University of Sorocaba (UNISO), stan São Paulo, Brazylia. Badanie zostało zatwierdzone (załącznik D) przez Komisję ds. Etyki Badań na Ludziach Uniwersytetu Sorocaba (protokół nr 2.824.297), zgodnie z Uchwałą 466/2012 Narodowej Rady Zdrowia (BRAZYLIA, 2012) oraz Komisję ds. Oceny Etyki Badań (ERC) (WHO, 2016).

Rekrutacja osób W przypadku rekrutacji osób ujawnienie rozpoczęto na pięć miesięcy przed rozpoczęciem badania fazy II. Wyniki badań opublikowano na stronie internetowej Uniwersytetu Sorocaba (UNISO), w mediach społecznościowych oraz w folderach rozsianych po całym kampusie, zawierających krótkie wyjaśnienie dotyczące badań, kryteriów włączenia i wykluczenia oraz kontaktu badacza. Zgodnie z Rezolucją 1.170, wydaną przez Anvisa (National Health Surveillance Agency), badania fazy II nie są dozwolone z udziałem mniej niż 12 osób; Agencja sugeruje jednak zatrudnienie co najmniej 24 ochotników.

Kryteria kwalifikacji Łącznie 165 osób wypełniło ankietę online Google.

• Kryteria włączenia Osoby w wieku od 20 do 65 lat, obojga płci, które miały co najmniej jeden z następujących markerów biochemicznych na poziomie granicznym (cholesterol całkowity od 180 do 239 mg/dl; LDL od 130 do 159 mg/dl; trójglicerydy od 150 do 200 mg/dL), zostali zrekrutowani, zdiagnozowani na podstawie badań biochemicznych z datami nie starszymi niż dzień rekrutacji. Bądź tolerancyjny na składniki batonów i na Shiitake. Możliwość uczestniczenia w dacie i godzinie pobrania krwi.
• Kryteria wykluczenia Jednak niektórzy z nich mieli między innymi choroby takie jak rak, choroby serca, choroby neurodegeneracyjne, cukrzyca. Choroby te można uznać za czynniki zakłócające badanie, a niektóre rekrutowane osoby musiały zostać wykluczone. Kobiety w ciąży, karmiące piersią lub kobiety stosujące terapię hormonalną również nie mogły uczestniczyć.

Osoby zostały poinstruowane, aby nie zmieniały swoich nawyków i nawyków żywieniowych, poziomu aktywności fizycznej ani stosowania doustnych środków antykoncepcyjnych podczas badania, identyfikując w ten sposób jedynie wpływ Shiitake dodany do diety dla każdej osoby w grupie narażonej.

Interwencje studyjne. Badanie oficjalnie rozpoczęło się od 68 osób, które podpisały świadomą zgodę. Na pierwszym (Czas 0 – T0), na drugim (Czas 33 dni – T33) i na trzecim (Czas 66 dni – T66) badanych poddano ocenie żywieniowej i wywiadowi, 24-godzinnemu przypomnieniu nawyków żywieniowych i częstotliwości jedzenia.

W pierwszym miesiącu badania wyprodukowano 4100 batonów placebo lub grzybów, aw drugim miesiącu wyprodukowano 3500 batonów. Według Grotto i współpracowników (2015), przeprowadzili badanie oceniające różne stężenia Shiitake (100, 400 i 800 mg/kg/dzień) w celu określenia stopnia toksyczności u zwierząt. Wykazano, że stężenie shiitake wynoszące 100 mg/kg/dzień jest bezpieczne. Poza tym receptura batonika Shiitake została zatwierdzona w analizie sensorycznej i intencji zakupu w poprzednim badaniu.

Randomizacja Osoby (68) zostały losowo przydzielone (za pomocą tabeli liczb losowych) do 2 grup: I - grupa placebo (n = 32) i II - grupa interwencyjna (n = 36). Aby zapewnić zalecane dzienne spożycie Shiitake w wysokości 100 mg/kg/dzień, każdy uczestnik został zważony w celu określenia liczby batonów spożywanych dziennie.

Osoby po ocenie stanu odżywienia i pobraniu krwi otrzymywały niezidentyfikowane nieprzejrzyste i szczelnie zamknięte opakowanie zawierające indywidualnie batony próżniowe na okres T33 dni. Pacjenci i osoba zbierająca dane byli niewidomi. Batony z grup interwencyjnych i placebo były podobne pod względem tekstury, smaku, zapachu i wyglądu.

Po miesiącu wszystkie osoby wróciły na Uniwersytet Sorocaba w celu przeprowadzenia nowych ocen żywieniowych, otrzymując więcej batonów żywnościowych i pobranie krwi z tą samą podwójnie ślepą opieką (T33). Pod koniec sześćdziesięciu sześciu dni (T66) badani wrócili na ostatnie pobranie krwi i ostateczną ocenę odżywienia.

Analiza biochemiczna Cholesterol całkowity, cholesterol LDL, cholesterol HDL, triglicerydy i glukozę analizowano za pomocą komercyjnych zestawów, zgodnie ze specyfikacjami producenta, w zautomatyzowanym sprzęcie COBAS C111 (Roche®) zgodnie z metodologiami podanymi poniżej.

W przypadku cholesterolu 10 µl próbki i 1,0 ml odczynnika enzymatycznego mieszano w temperaturze 37°C przez 10 minut w celu całkowitego przekształcenia w wolny cholesterol za pomocą enzymu lipazy lipoproteinowej. Reakcja obejmowała utlenianie wolnego cholesterolu do cholesterolu-3-onu i H2O2 przez enzym oksydazę cholesterolową. A przy działaniu peroksydazy na fenol z 4-aminoantypiryną tworzył chromogen wiśniowy, którego kolor był proporcjonalny do stężenia cholesterolu.

W celu oznaczenia HDL surowicę potraktowano kwasem fosforowolframowym i chlorkiem magnezu. Tak więc LDL wytrącił się z frakcji po wirowaniu przez 2 minuty przy 10 000 obrotów na minutę. HDL, który pozostał w supernatancie, wykonano zgodnie z metodologią cholesterolową. Stężenie HDL jest proporcjonalne do koloru. LDL obliczono odejmując cholesterol HDL od cholesterolu całkowitego.

Triglicerydy w surowicy były hydrolizowane do glicerolu i wolnych kwasów tłuszczowych przez lipazę lipoproteinową. W obecności trifosforanu adenozyny (ATP) i kinazy glicerolowej dochodzi do fosforylacji 3-fosforanu glicerolu, który zostaje utleniony do diwodorofosforanu acetonu i H2O2 przez oksydazę fosforanu glicerolu. H2O2, 4-aminoantypiryna i p-chlorofenol przeszły ten sam proces reakcji opisany powyżej z peroksydazą w łaźni wodnej o temperaturze 37 ºC przez 10 minut, aż do powstania czerwonego koloru.

W teście glukozy we krwi dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa utleniała glukozo-6-fosforan w obecności NADP w glukoniano-6-fosforanie. Żadne inne węglowodany nie zostały utlenione. Szybkość tworzenia NADPH podczas reakcji była wprost proporcjonalna do stężenia glukozy, które określano fotometrycznie.

Analiza stresu oksydacyjnego Oznaczenie zredukowanego glutationu (GSH) wykonano przez oznaczenie ilościowe zredukowanej całkowitej liczby tioli na podstawie. W tym celu 150 µl krwi wytrząsano z 100 µl 10% Triton X-100 i 100 µl 30% TCA, a następnie wirowano przez 10 minut przy 4000 obr./min. Do kuwety odpipetowano 900 µl 1M TFK, 50 µl supernatantu i 50 µl 10 mM DTNB, które przereagowały tworząc żółty kompleks. Odczyt wykonano przy 412 nm w spektrofotometrze. Do obliczenia stężenia wykorzystano krzywą kalibracyjną z predefiniowanymi stężeniami GSH (0,005; 0,01; 0,025; 0,05; 0,1 mM).

Do oceny aktywności katalazy zastosowano enzym oparty na rozkładzie H2O2 przez katalazę, monitorowanym przy 240 nm. W tym celu krew rozcieńczono 60 razy w 50 mM TFK. Porcję 20 μl zmieszano z 1910 μl tego samego TFK i dodano 70 μl H2O2, inicjując monitorowaną reakcję przez trzy minuty. Stała zmienności (κ) na minutę pomogła w ekspresji enzymu katalazy (κ/min).

Substancje reagujące z kwasem tiobarbiturowym (TBARS) wykorzystano jako biomarker peroksydacji lipidów. Porcje osocza (150 µl) zmieszano z 50 µl NaOH i 50 µl ultraczystej wody Milli-Q (Direct 8, Millipore®) i inkubowano w temperaturze 60°C przez 30 minut z wytrząsaniem. Do próbek dodano 250 ul 6% H3PO4, 250 ul 0,8% TBA i 100 ul 10% SDS i umieszczono w łaźni o temperaturze 80°C na jedną godzinę. Nadtlenki lipidów reagowały z TBA w kwaśnym środowisku, tworząc różowy związek i odczytywano w spektrofotometrze przy 532 nm. Aby obliczyć stężenie TBARS w osoczu, sporządzono krzywą kalibracyjną dialdehydu malonowego, głównej substancji reagującej z kwasem tiobarbiturowym (0,28; 0,56; 1,7; 3,4; 6,6 µM).