Effets des barres de Lentinula Edodes sur la dyslipidémie et le stress oxydatif chez les personnes atteintes de cholestérol : étude randomisée

Conception de l'étude Le principal résultat de l'étude était la cholestérolémie, évaluée par les taux de cholestérol total, les triglycérides ou les lipoprotéines de basse densité (LDL) et les lipoprotéines de haute densité (HDL). Les résultats secondaires comprenaient la glycémie, l'indice de masse corporelle (IMC) et les biomarqueurs du stress oxydatif.

Un essai prospectif de phase II, randomisé, en double aveugle et contrôlé par placebo a été mené de septembre 2018 à décembre 2018. L'étude a été réalisée à l'Université de Sorocaba (UNISO), État de São Paulo, Brésil. L'étude a été approuvée (annexe D) par le comité d'éthique de la recherche humaine de l'Université de Sorocaba (numéro de protocole 2.824.297), conformément à la résolution 466/2012 du Conseil national de la santé (BRASIL, 2012) et au comité d'examen de l'éthique de la recherche (ERC) (OMS, 2016).

Recrutement des individus Pour le recrutement des individus, la divulgation a été initiée cinq mois avant le début de l'essai de phase II. La recherche a été publiée sur le site Web de l'Université de Sorocaba (UNISO), sur les médias sociaux et dans des dossiers distribués sur le campus contenant une brève explication sur la recherche, les critères d'inclusion et d'exclusion et le contact du chercheur. Selon la résolution 1.170, de l'Anvisa (Agence nationale de surveillance de la santé), les études de phase II ne sont pas autorisées avec moins de 12 personnes ; cependant, l'Agence suggère d'utiliser un minimum de 24 bénévoles.

Critères d'admissibilité Au total, 165 personnes ont répondu au sondage en ligne de Google.

• Critères d'inclusion Personnes âgées de 20 à 65 ans, des deux sexes, qui avaient au moins un des marqueurs biochimiques suivants au niveau limite (cholestérol total 180 à 239 mg/dL ; LDL 130 à 159 mg/dL ; triglycérides de 150 à 200 mg/dL), ont été recrutés, diagnostiqués par des examens biochimiques avec des dates récentes au jour du recrutement. Soyez tolérant aux ingrédients des barres et au Shiitake. Disponibilité pour assister à la date et à l'heure du prélèvement sanguin.
• Critères d'exclusion Cependant, certains d'entre eux souffraient de maladies telles que le cancer, les maladies cardiaques, les maladies neurodégénératives, le diabète, entre autres. Ces maladies pouvaient être considérées comme des facteurs de confusion de l'étude et certaines personnes recrutées ont dû être exclues. Les femmes enceintes, allaitantes ou substitutives hormonales ne pouvaient pas non plus participer.

Les individus ont reçu pour instruction de ne pas modifier leurs habitudes et habitudes alimentaires, leur niveau d'activité physique ou leur utilisation de contraceptifs oraux au cours de l'étude, identifiant ainsi uniquement les effets du shiitake ajouté au régime alimentaire de chaque individu du groupe exposé.

Interventions d'étude. L'étude a officiellement débuté avec 68 personnes, qui ont signé un consentement éclairé. Lors de la première (Temps 0 - T0), de la deuxième (Temps 33 jours - T33) et de la troisième (Temps 66 jours - T66), les sujets ont été soumis à un bilan nutritionnel et à une anamnèse, rappel de 24 heures des habitudes alimentaires et la fréquence des repas.

Au cours du premier mois de l'étude, 4 100 barres placebo ou champignons ont été produites et au cours du deuxième mois, la production était de 3 500 barres. Selon la Grotto et collaborateurs (2015), ont mené une étude évaluant différentes concentrations de Shiitake (100, 400 et 800 mg/Kg/jour) pour déterminer le degré de toxicité chez les animaux. Une concentration de shiitake de 100 mg/Kg/jour s'est avérée sans danger. En outre, la formulation de la barre sucrée Shiitake a été approuvée dans l'analyse sensorielle et l'intention d'achat dans l'étude précédente.

Randomisation Les individus (68) ont été répartis aléatoirement (à l'aide d'une table de nombres aléatoires) en 2 groupes : I - Groupe placebo (n = 32) et II - Groupe intervention (n = 36). Afin d'assurer l'apport quotidien recommandé de Shiitake de 100 mg/Kg/jour, chaque participant a été pondéré pour déterminer le nombre de barres consommées par jour.

Les Individus après bilan nutritionnel et prélèvement sanguin, ont reçu un emballage opaque et scellé non identifié contenant individuellement des barres sous vide pour une durée de T33 jours. Les patients et le collecteur de données étaient aveugles. Les barres des groupes d'intervention et placebo étaient similaires en termes de texture, de saveur, d'arôme et d'apparence.

Après un mois, tous les individus sont retournés à l'Université de Sorocaba pour de nouvelles évaluations nutritionnelles, recevant plus de barres alimentaires et de collecte de sang avec les mêmes soins en double aveugle (T33). Au bout de soixante-six jours (T66), les sujets sont revenus pour la dernière prise de sang et le bilan nutritionnel final.

Analyses biochimiques Le cholestérol total, le cholestérol LDL, le cholestérol HDL, les triglycérides et le glucose ont été analysés par des kits commerciaux, suivant les spécifications du fabricant, dans l'équipement automatisé COBAS C111 (Roche®) selon les méthodologies ci-dessous.

Pour le cholestérol, 10 µL d'échantillon et 1,0 mL de réactif enzymatique ont été mélangés à 37 ºC pendant 10 min pour la transformation totale en cholestérol libre, par l'enzyme lipoprotéine lipase. La réaction impliquait l'oxydation du cholestérol libre en cholestérol-3-one et H2O2 par l'enzyme cholestérol oxydase. Et avec l'action de la peroxydase sur le phénol avec la 4-aminoantipyrine formé un chromogène cerise, la couleur étant proportionnelle à la concentration en cholestérol.

Pour la détermination des HDL, le sérum a été traité avec de l'acide phosphotungstate et du chlorure de magnésium. Ainsi, le LDL a été précipité de la fraction après centrifugation pendant 2 min à 10 000 tr/min. La HDL, qui restait dans le surnageant, a été réalisée selon la méthodologie du cholestérol. La concentration en HDL est proportionnelle à la couleur. Le LDL a été calculé en soustrayant le cholestérol HDL du cholestérol total.

Les triglycérides sériques ont été hydrolysés en glycérol et en acides gras libres par la lipoprotéine lipase. En présence d'adénosine triphosphate (ATP) et de glycérol kinase, le glycérol-3-phosphate a été phosphorylé, qui a été oxydé en acétone dihydrogénophosphate et H2O2 par la glycérol phosphate oxydase. H2O2, 4-aminoantipyrine et p-chlorophénol ont subi le même processus de réaction rapporté ci-dessus par la peroxydase dans un bain-marie à 37 ºC pendant 10 minutes jusqu'à la formation d'une couleur rouge.

Pour le test de glycémie, la glucose-6-phosphate déshydrogénase a oxydé le glucose-6-phosphate en présence de NADP dans le gluconate-6-phosphate. Aucun autre glucide n'a été oxydé. Le taux de formation de NADPH au cours de la réaction était directement proportionnel à la concentration de glucose, étant déterminé par photométrie.

Analyse du stress oxydatif Le dosage du glutathion réduit (GSH) a été effectué par quantification des thiols totaux réduits à base. Pour cela, 150 µL de sang ont été vortexés avec 100 µL 10% Triton X-100 et 100 µL 30% TCA, puis centrifugés 10 min à 4000 rpm. Dans la cuvette, 900 µL de TFK 1 M, 50 µL de surnageant et 50 µL de DTNB 10 mM ont été pipetés, qui ont réagi pour former un complexe jaune. La lecture a été effectuée à 412 nm dans un spectrophotomètre. Pour le calcul de la concentration, la courbe d'étalonnage avec des concentrations de GSH prédéfinies (0,005 ; 0,01 ; 0,025 ; 0,05 ; 0,1 mM) a été utilisée.

Pour évaluer l'activité de l'enzyme catalase a été utilisée, basée sur la décomposition de H2O2 par la catalase, contrôlée à 240 nm. Pour cela, le sang a été dilué 60 fois dans du TFK 50 mM. Une aliquote de 20 μL a été mélangée à 1910 μL du même TFK, et 70 μL de H2O2 ont été ajoutés, initiant la réaction surveillée pendant trois minutes. Une constante de variation (κ) par minute a contribué à l'expression de l'enzyme catalase (κ/min).

Les substances réactives à l'acide thiobarbiturique (TBARS) ont été utilisées comme biomarqueur de la peroxydation lipidique. Des aliquotes de plasma (150 µL) ont été mélangées avec 50 µL de NaOH et 50 µL d'eau ultrapure Milli-Q (Direct 8, Millipore®) et incubées à 60 °C pendant 30 minutes sous agitation. 250 µL de H₃PO₄ à 6 %, 250 µL de TBA à 0,8 % et 100 µL de SDS à 10 % ont été ajoutés aux échantillons et placés dans le bain à 80 °C pendant une heure. Les peroxydes lipidiques ont réagi avec le TBA en milieu acide pour former un composé rose et lu dans un spectrophotomètre à 532 nm. Pour calculer la concentration de TBARS dans le plasma, une courbe d'étalonnage du malondialdéhyde, la principale substance réactive à l'acide thiobarbiturique, a été réalisée (0,28 ; 0,56 ; 1,7 ; 3,4 ; 6,6 µM).