Auswirkungen von Lentinula-Edodes-Riegeln auf Dyslipidämie und oxidativen Stress bei Cholesterin-Personen: Randomisierte Studie

Studiendesign Das primäre Ergebnis der Studie war die Cholesterinämie, die durch Gesamtcholesterinspiegel, Triglyceride oder Low-Density-Lipoproteine ​​(LDL) und High-Density-Lipoproteine ​​(HDL) bestimmt wurde. Die sekundären Ergebnisse umfassten Blutzucker, Body-Mass-Index (BMI) und Biomarker für oxidativen Stress.

Von September 2018 bis Dezember 2018 wurde eine prospektive, randomisierte, doppelblinde und placebokontrollierte Phase-II-Studie durchgeführt. Die Studie wurde an der Universität von Sorocaba (UNISO), Bundesstaat São Paulo, Brasilien, durchgeführt. Die Studie wurde vom Human Research Ethics Committee der University of Sorocaba (Protokollnummer 2.824.297) gemäß der Resolution 466/2012 des National Health Council (BRASIL, 2012) und des Research Ethics Review Committee (ERC) genehmigt (Anhang D). (WHO, 2016).

Rekrutierung von Personen Für die Rekrutierung von Personen wurde die Offenlegung fünf Monate vor Beginn der Phase-II-Studie eingeleitet. Die Forschung wurde auf der Website der Universität von Sorocaba (UNISO), in sozialen Medien und auf dem gesamten Campus verteilten Ordnern veröffentlicht, die eine kurze Erklärung über die Forschung, Einschluss- und Ausschlusskriterien und den Kontakt des Forschers enthielten. Gemäß der Resolution 1.170 der Anvisa (National Health Surveillance Agency) sind Phase-II-Studien mit weniger als 12 Personen nicht erlaubt; Die Agentur schlägt jedoch vor, mindestens 24 Freiwillige einzusetzen.

Auswahlkriterien Insgesamt 165 Personen haben an der Online-Umfrage von Google teilgenommen.

• Einschlusskriterien Personen im Alter von 20 bis 65 Jahren beider Geschlechter, die mindestens einen der folgenden biochemischen Marker im Grenzbereich aufwiesen (Gesamtcholesterin 180 bis 239 mg/dl; LDL 130 bis 159 mg/dl; Triglyceride von 150 bis 200 mg/dL), wurden rekrutiert, diagnostiziert durch biochemische Untersuchungen mit Daten vor dem Tag der Rekrutierung. Sie müssen tolerant gegenüber Riegelbestandteilen und gegenüber Shiitake sein. Verfügbarkeit, um am Datum und der Uhrzeit der Blutentnahme teilzunehmen.
• Ausschlusskriterien Einige von ihnen hatten jedoch unter anderem Krankheiten wie Krebs, Herzerkrankungen, neurodegenerative Erkrankungen, Diabetes. Diese Krankheiten konnten als Confounder der Studie angesehen werden und einige rekrutierte Personen mussten ausgeschlossen werden. Schwangere, stillende oder Hormonersatz-Frauen konnten ebenfalls nicht teilnehmen.

Die Personen wurden angewiesen, ihre Essgewohnheiten und -muster, ihr körperliches Aktivitätsniveau oder ihre Einnahme von oralen Kontrazeptiva während der Studie nicht zu ändern, wodurch nur die Auswirkungen von Shiitake, das der Ernährung für jede Person auf die exponierte Gruppe hinzugefügt wurde, identifiziert wurden.

Studieninterventionen. Die Studie begann offiziell mit 68 Personen, die eine informierte Einverständniserklärung unterzeichneten. In der ersten (Zeitpunkt 0 – T0), in der zweiten (Zeitpunkt 33 Tage – T33) und in der dritten (Zeitpunkt 66 Tage – T66) Sitzung wurden die Probanden einer Ernährungsbeurteilung und Anamnese unterzogen, 24-Stunden-Erinnerung an Essgewohnheiten und Fresshäufigkeit.

Im ersten Monat der Studie wurden 4.100 Placebo- oder Pilzriegel produziert und im zweiten Monat betrug die Produktion 3.500 Riegel. Laut Grotto und Mitarbeitern (2015) wurde eine Studie durchgeführt, in der verschiedene Shiitake-Konzentrationen (100, 400 und 800 mg/kg/Tag) bewertet wurden, um den Grad der Toxizität bei Tieren zu bestimmen. Eine Shiitake-Konzentration von 100 mg/kg/Tag hat sich als sicher erwiesen. Außerdem wurde die Formulierung des süßen Shiitake-Riegels in der sensorischen Analyse und Kaufabsicht in der vorherigen Studie zugelassen.

Randomisierung Die Personen (68) wurden nach dem Zufallsprinzip (unter Verwendung einer Tabelle mit Zufallszahlen) in 2 Gruppen eingeteilt: I – Placebo-Gruppe (n = 32) und II – Interventionsgruppe (n = 36). Um die täglich empfohlene Aufnahme von Shiitake von 100 mg/kg/Tag zu gewährleisten, wurde jeder Teilnehmer gewogen, um die Anzahl der pro Tag konsumierten Riegel zu bestimmen.

Die Personen erhielten nach Ernährungsbeurteilung und Blutentnahme eine nicht identifizierte undurchsichtige und versiegelte Verpackung, die einzelne Vakuumstäbe für einen Zeitraum von T33 Tagen enthielt. Die Patienten und der Datensammler waren blind. Die Riegel der Interventions- und der Placebogruppe waren in Textur, Geschmack, Aroma und Aussehen ähnlich.

Nach einem Monat kehrten alle Personen für neue Ernährungsbewertungen an die Universität von Sorocaba zurück und erhielten mehr Nahrungsriegel und Blutentnahmen mit der gleichen doppelblinden Behandlung (T33). Am Ende der sechsundsechzig Tage (T66) kehrten die Probanden zur letzten Blutentnahme und abschließenden Ernährungsbeurteilung zurück.

Biochemische Analyse Gesamtcholesterin, LDL-Cholesterin, HDL-Cholesterin, Triglyceride und Glucose wurden mit handelsüblichen Kits nach den Angaben des Herstellers in der automatisierten Anlage COBAS C111 (Roche®) nach den nachstehenden Methoden analysiert.

Für Cholesterin wurden 10 &mgr;l Probe und 1,0 ml Enzymreagenz bei 37°C für 10 min zur vollständigen Umwandlung in freies Cholesterin durch das Lipoproteinlipase-Enzym gemischt. Die Reaktion umfasste die Oxidation von freiem Cholesterin zu Cholesterin-3-on und H2O2 durch das Enzym Cholesterinoxidase. Und mit der Einwirkung von Peroxidase auf Phenol mit 4-Aminoantipyrin bildete sich ein Kirschchromogen, dessen Farbe proportional zur Cholesterinkonzentration war.

Zur HDL-Bestimmung wurde das Serum mit Phosphorwolframatsäure und Magnesiumchlorid behandelt. So wurde das LDL nach Zentrifugation für 2 min bei 10.000 U/min aus der Fraktion ausgefällt. HDL, das im Überstand verblieb, wurde gemäß der Cholesterin-Methodik durchgeführt. Die HDL-Konzentration ist proportional zur Farbe. LDL wurde berechnet, indem HDL-Cholesterin vom Gesamtcholesterin abgezogen wurde.

Serumtriglyceride wurden durch Lipoproteinlipase zu Glycerin und freien Fettsäuren hydrolysiert. In Gegenwart von Adenosintriphosphat (ATP) und Glycerolkinase wurde Glycerol-3-phosphat phosphoryliert, das durch die Glycerolphosphatoxidase zu Acetondihydrogenphosphat und H2O2 oxidiert wurde. H2O2, 4-Aminoantipyrin und p-Chlorphenol durchliefen denselben Reaktionsprozess wie oben beschrieben durch Peroxidase in einem 37°C warmen Wasserbad für 10 Minuten bis zur Bildung einer roten Farbe.

Für den Blutglukosetest oxidierte Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Glucose-6-Phosphat in Anwesenheit von NADP in Gluconat-6-Phosphat. Keine anderen Kohlenhydrate wurden oxidiert. Die Rate der NADPH-Bildung während der Reaktion war direkt proportional zur Glucosekonzentration, die photometrisch bestimmt wurde.

Oxidative Stressanalyse Die Bestimmung von reduziertem Glutathion (GSH) erfolgte durch Quantifizierung der reduzierten Gesamtthiole. Dazu wurden 150 µL des Blutes mit 100 µL 10 % Triton X-100 und 100 µL 30 % TCA gevortext, dann 10 min bei 4000 U/min zentrifugiert. In die Küvette wurden 900 µL 1 M TFK, 50 µL Überstand und 50 µL 10 mM DTNB pipettiert, die zu einem gelben Komplex reagierten. Die Ablesung erfolgte bei 412 nm in einem Spektrophotometer. Für die Konzentrationsberechnung wurde die Kalibrierkurve mit vordefinierten GSH-Konzentrationen (0,005; 0,01; 0,025; 0,05; 0,1 mM) verwendet.

Zur Bewertung wurde die Aktivität des Katalase-Enzyms verwendet, basierend auf der Zersetzung von H2O2 durch Katalase, überwacht bei 240 nm. Dazu wurde das Blut 60-fach in 50 mM TFK verdünnt. Ein Aliquot von 20 μl wurde mit 1910 μl des gleichen TFK gemischt und 70 μl H2O2 wurden hinzugefügt, wodurch die überwachte Reaktion für drei Minuten gestartet wurde. Eine Variationskonstante (κ) pro Minute half bei der Expression des Katalase-Enzyms (κ/min).

Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen (TBARS) wurden als Biomarker der Lipidperoxidation verwendet. Plasmaaliquots (150 &mgr;l) wurden mit 50 &mgr;l NaOH und 50 &mgr;l Milli-Q ultrareinem Wasser (Direct 8, Millipore®) gemischt und 30 Minuten lang unter Schütteln bei 60°C inkubiert. 250 ul 6 % H&sub3;PO&sub4;, 250 ul 0,8 % TBA und 100 ul 10 % SDS wurden zu den Proben gegeben und für eine Stunde in das 80ºC-Bad gebracht. Lipidperoxide reagierten mit TBA in saurem Medium unter Bildung einer rosafarbenen Verbindung und wurden in einem Spektrophotometer bei 532 nm abgelesen. Um die Konzentration von TBARS im Plasma zu berechnen, wurde eine Kalibrierungskurve von Malondialdehyd, der wichtigsten Thiobarbitursäure-reaktiven Substanz, erstellt (0,28; 0,56; 1,7; 3,4; 6,6 &mgr;M).