Effekter av Lentinula Edodes Bars på dyslipidemi og oksidativt stress hos kolesterolindivider: Randomisert studie

Studiedesign Det primære resultatet av studien var kolesterolemi, vurdert ved totalkolesterolnivåer, triglyserider eller lavdensitetslipoproteiner (LDL) og høydensitetslipoproteiner (HDL). De sekundære resultatene inkluderte blodsukker, kroppsmasseindeks (BMI) og biomarkører for oksidativt stress.

En prospektiv fase II, randomisert, dobbeltblind og placebokontrollert studie ble utført fra september 2018 til desember 2018. Studien ble utført ved University of Sorocaba (UNISO), São Paulo State, Brasil. Studien ble godkjent (vedlegg D) av Human Research Ethics Committee fra University of Sorocaba (protokollnummer 2.824.297), i samsvar med resolusjon 466/2012 fra National Health Council (BRASIL, 2012) og Research Ethics Review Committee (ERC) (WHO, 2016).

Rekruttering av individer For rekruttering av individer ble avsløringen igangsatt fem måneder før starten av fase II-studien. Forskningen ble publisert på nettstedet til University of Sorocaba (UNISO), på sosiale medier og mapper distribuert over hele campus som inneholder en kort forklaring om forskningen, inkluderings- og eksklusjonskriterier, og kontakt med forskeren. I henhold til resolusjon 1.170, fra Anvisa (National Health Surveillance Agency), er fase II-studier ikke tillatt med mindre enn 12 personer; Byrået foreslår imidlertid å bruke minimum 24 frivillige.

Kvalifikasjonskriterier Totalt 165 personer fullførte Googles nettundersøkelse.

• Inklusjonskriterier Individer i alderen 20 til 65 år, av begge kjønn, som hadde minst én av følgende biokjemiske markører på grensenivået (totalt kolesterol 180 til 239 mg/dL; LDL 130 til 159 mg/dL; triglyserider på 150 til 200 mg/dL), ble rekruttert, diagnostisert ved biokjemiske undersøkelser med datoer nylig til rekrutteringsdagen. Vær tolerant overfor barer og Shiitake. Tilgjengelighet til å delta på dato og klokkeslett for blodprøvetaking.
• Eksklusjonskriterier Noen av dem hadde imidlertid sykdommer som blant annet kreft, hjertesykdom, nevrodegenerativ sykdom, diabetes. Disse sykdommene kunne betraktes som forstyrrelser av studien, og noen rekrutterte personer måtte ekskluderes. Gravide, ammende eller hormonerstattende kvinner kunne heller ikke delta.

Enkeltpersoner ble instruert om å ikke endre matvaner og mønstre, fysisk aktivitetsnivå eller oral prevensjonsbruk under studien, og identifiserte dermed bare effektene av Shiitake lagt til dietten for hvert individ på den eksponerte gruppen.

Studieintervensjoner. Studien startet offisielt med 68 personer, som signerte en informert samtykkeerklæring. I det første (Tid 0 - T0), i det andre (Tid 33 dager - T33) og i det tredje (Tid 66 dager - T66) møtet ble forsøkspersonene underkastet ernæringsvurdering og anamnese, 24-timers tilbakekalling av spisevaner og spisefrekvens.

I den første måneden av studien ble det produsert 4100 placebo- eller soppstenger, og i den andre måneden var produksjonen 3500 barer. I følge grotten og medarbeidere (2015), gjennomførte en studie som evaluerte forskjellige Shiitake-konsentrasjoner (100, 400 og 800 mg/kg/dag) for å bestemme graden av toksisitet hos dyr. Shiitake-konsentrasjon på 100 mg/kg/dag har vist seg å være trygg. Dessuten ble Shiitake søtbar-formuleringen godkjent i den sensoriske analysen og kjøpsintensjonen i den forrige studien.

Randomisering Individene (68) ble tilfeldig fordelt (ved hjelp av en tabell med tilfeldige tall) i 2 grupper: I - Placebogruppe (n = 32) og II - Intervensjonsgruppe (n = 36). For å sikre det daglige anbefalte inntaket av Shiitake på 100 mg/kg/dag, ble hver deltaker vektet for å bestemme antall barer som ble konsumert per dag.

Personene fikk etter ernæringsvurdering og blodprøvetaking en uidentifisert ugjennomsiktig og forseglet pakning som inneholdt individuelle vakuumstenger i en periode på T33 dager. Pasientene og datainnsamleren var blinde. Stolpene i intervensjons- og placebogruppene var like i tekstur, smak, aroma og utseende.

Etter en måned returnerte alle individer til University of Sorocaba for nye ernæringsvurderinger, og fikk flere matbarer og blodprøvetaking med samme dobbeltblinde omsorg (T33). Ved slutten av sekstiseks dager (T66) kom forsøkspersonene tilbake for siste blodprøvetaking og endelig ernæringsvurdering.

Biokjemisk analyse Totalkolesterol, LDL-kolesterol, HDL-kolesterol, triglyserider og glukose ble analysert med kommersielle sett, etter produsentens spesifikasjoner, i det automatiserte utstyret COBAS C111 (Roche®) i henhold til metodene nedenfor.

For kolesterol ble 10 µL prøve og 1,0 mL enzymreagens blandet ved 37 ºC i 10 minutter for total transformasjon til fritt kolesterol ved hjelp av lipoproteinlipaseenzym. Reaksjonen involverte oksidasjon av fritt kolesterol til kolesterol-3-on og H2O2 av kolesteroloksidase-enzymet. Og med virkningen av peroksidase på fenol med 4-aminoantipyrin dannet et kirsebærkromogen, fargen er proporsjonal med konsentrasjonen av kolesterol.

For bestemmelse av HDL ble serumet behandlet med fosfowolframatsyre og magnesiumklorid. Så LDL ble presipitert ut fra fraksjonen etter sentrifugering i 2 minutter ved 10.000 rpm. HDL, som forble i supernatanten, ble utført i henhold til kolesterolmetodikken. HDL-konsentrasjonen er proporsjonal med fargen. LDL ble beregnet ved å trekke HDL-kolesterol fra totalkolesterol.

Serumtriglyserider ble hydrolysert til glyserol og fri fettsyre av lipoproteinlipase. I nærvær av adenosintrifosfat (ATP) og glyserolkinase ble glyserol-3-fosfat fosforylert, som ble oksidert til acetondihydrogenfosfat og H2O2 av glyserolfosfatoksidase. H2O2, 4-aminoantipyrin og p-klorfenol gjennomgikk den samme reaksjonsprosessen som er rapportert ovenfor med peroksidase i et 37 ºC vannbad i 10 minutter inntil dannelse av rød farge.

For blodsukkertesten oksiderte glukose-6-fosfatdehydrogenase glukose-6-fosfat i nærvær av NADP i glukonat-6-fosfat. Ingen andre karbohydrater har blitt oksidert. Hastigheten av NADPH-dannelse under reaksjonen var direkte proporsjonal med glukosekonsentrasjonen, og ble bestemt fotometrisk.

Oksidativ stressanalyse Bestemmelsen av redusert glutation (GSH) ble gjort ved å kvantifisere reduserte totale tioler basert. For dette ble 150 µL av blodet vortexet med 100 µL 10 % Triton X-100 og 100 µL 30 % TCA, deretter sentrifugert i 10 minutter ved 4000 rpm. I kyvetten ble 900 µL 1 M TFK, 50 µL supernatant og 50 µL 10 mM DTNB pipettert, som reagerte og dannet et gult kompleks. Avlesningen ble tatt ved 412 nm i et spektrofotometer. For beregning av konsentrasjon ble kalibreringskurven med forhåndsdefinerte GSH-konsentrasjoner (0,005; 0,01; 0,025; 0,05; 0,1 mM) brukt.

For å evaluere aktiviteten til katalase ble enzymet brukt, basert på dekomponering av H2O2 ved katalase, overvåket ved 240 nm. For dette ble blodet fortynnet 60 ganger i 50 mM TFK. En alikvot på 20 μL ble blandet til 1910 μL av samme TFK, og 70 μL H2O2 ble tilsatt, og startet den overvåkede reaksjonen i tre minutter. En variasjonskonstant (κ) per minutt hjalp til med uttrykket av katalaseenzym (κ/min).

Tiobarbitursyrereaktive stoffer (TBARS) ble brukt som en biomarkør for lipidperoksidasjon. Plasmaalikvoter (150 µL) ble blandet med 50 µL NaOH og 50 µL Milli-Q ultrarent vann (Direct 8, Millipore®) og inkubert ved 60 °C i 30 minutter under risting. 250 ul 6 % H3PO4, 250 ul 0,8 % TBA og 100 ul 10 % SDS ble tilsatt til prøvene og tatt til 80 °C badet i én time. Lipidperoksider reagerte med TBA i surt medium for å danne en rosa forbindelse og ble avlest i et spektrofotometer ved 532 nm. For å beregne konsentrasjonen av TBARS i plasma ble det laget en kalibreringskurve for malondialdehyd, det viktigste reaktive stoffet for tiobarbitursyre (0,28; 0,56; 1,7; 3,4; 6,6 µM).