Efectos de las barras de Lentinula Edodes sobre la dislipidemia y el estrés oxidativo en individuos con colesterol: estudio aleatorizado

Diseño del estudio El resultado primario del estudio fue la colesterolemia, evaluada por los niveles de colesterol total, triglicéridos o lipoproteínas de baja densidad (LDL) y lipoproteínas de alta densidad (HDL). Los resultados secundarios incluyeron glucosa en sangre, índice de masa corporal (IMC) y biomarcadores de estrés oxidativo.

Se realizó un ensayo prospectivo de fase II, aleatorizado, doble ciego y controlado con placebo desde septiembre de 2018 hasta diciembre de 2018. El estudio se realizó en la Universidad de Sorocaba (UNISO), Estado de São Paulo, Brasil. El estudio fue aprobado (Anexo D) por el Comité de Ética en Investigación con Seres Humanos de la Universidad de Sorocaba (número de protocolo 2.824.297), de conformidad con la Resolución 466/2012 del Consejo Nacional de Salud (BRASIL, 2012) y Comité de Revisión de Ética en Investigación (ERC) (OMS, 2016).

Reclutamiento de individuos Para el reclutamiento de individuos, la divulgación se inició cinco meses antes del inicio de la Fase II del ensayo. La investigación fue publicada en el sitio web de la Universidad de Sorocaba (UNISO), en las redes sociales y en carpetas distribuidas por todo el campus que contenían una breve explicación sobre la investigación, los criterios de inclusión y exclusión y el contacto del investigador. Según la Resolución 1.170, de la Anvisa (Agencia Nacional de Vigilancia Sanitaria), no se permiten estudios de Fase II con menos de 12 personas; sin embargo, la Agencia sugiere usar un mínimo de 24 voluntarios.

Criterios de elegibilidad Un total de 165 personas completaron la encuesta en línea de Google.

• Criterios de inclusión Individuos de 20 a 65 años, de ambos sexos, que tuvieran al menos uno de los siguientes marcadores bioquímicos en el nivel límite (colesterol total 180 a 239 mg/dL; LDL 130 a 159 mg/dL; triglicéridos de 150 a 200 mg/dL), fueron reclutados, diagnosticados por exámenes bioquímicos con fechas recientes al día del reclutamiento. Ser tolerante a los ingredientes de las barritas y al Shiitake. Disponibilidad para asistir el día y hora de la extracción de sangre.
• Criterios de Exclusión Sin embargo, algunos de ellos presentaban enfermedades como cáncer, cardiopatías, enfermedades neurodegenerativas, diabetes, entre otras. Estas enfermedades podrían considerarse factores de confusión del estudio y algunas personas reclutadas tuvieron que ser excluidas. Tampoco pudieron participar mujeres embarazadas, lactantes o de reemplazo hormonal.

Se instruyó a los individuos para que no cambiaran sus hábitos y patrones alimentarios, nivel de actividad física o uso de anticonceptivos orales durante el estudio, identificando así solo los efectos del Shiitake agregado a la dieta de cada individuo en el grupo expuesto.

Intervenciones de estudio. El estudio comenzó oficialmente con 68 personas, que firmaron un término de consentimiento informado. En la primera (Tiempo 0 - T0), en la segunda (Tiempo 33 días - T33) y en la tercera (Tiempo 66 días - T66) reuniones, los sujetos fueron sometidos a evaluación nutricional y anamnesis, recordatorio de hábitos alimentarios de 24 horas y frecuencia de alimentación.

En el primer mes del estudio se produjeron 4.100 barras de placebo o de hongos y en el segundo mes la producción fue de 3.500 barras. Según Grotto y colaboradores (2015), realizaron un estudio evaluando diferentes concentraciones de Shiitake (100, 400 y 800 mg/Kg/día) para determinar el grado de toxicidad en animales. Se ha demostrado que la concentración de shiitake de 100 mg/Kg/día es segura. Además, la formulación de barra dulce Shiitake fue aprobada en el análisis sensorial e intención de compra en el estudio anterior.

Aleatorización Los individuos (68) fueron asignados al azar (usando una tabla de números aleatorios) en 2 grupos: I - Grupo de placebo (n = 32) y II - Grupo de intervención (n = 36). Para asegurar la ingesta diaria recomendada de Shiitake de 100 mg/Kg/día, se pesó a cada participante para determinar el número de barras consumidas por día.

Los Individuos, después de la evaluación nutricional y la extracción de sangre, recibieron un paquete opaco y sellado no identificado que contenía barras de vacío individuales por un período de T33 días. Los pacientes y el recolector de datos estaban ciegos. Las barras de los grupos de intervención y placebo fueron similares en textura, sabor, aroma y apariencia.

Después de un mes, todos los individuos regresaron a la Universidad de Sorocaba para nuevas evaluaciones nutricionales, recibiendo más barras de alimentos y extracción de sangre con el mismo cuidado doble ciego (T33). Al final de los sesenta y seis días (T66), los sujetos regresaron para la última extracción de sangre y la evaluación nutricional final.

Análisis bioquímico El colesterol total, colesterol LDL, colesterol HDL, triglicéridos y glucosa se analizaron mediante kits comerciales, siguiendo las especificaciones del fabricante, en el equipo automatizado COBAS C111 (Roche®) según las metodologías siguientes.

Para el colesterol, se mezclaron 10 µL de muestra y 1,0 mL de reactivo enzimático a 37 ºC durante 10 min para su transformación total en colesterol libre, por la enzima lipoproteína lipasa. La reacción implicó la oxidación del colesterol libre a colesterol-3-ona y H2O2 por la enzima colesterol oxidasa. Y con la acción de la peroxidasa sobre el fenol con la 4-aminoantipirina se formó un cromógeno cereza, siendo el color proporcional a la concentración de colesterol.

Para la determinación de HDL, el suero se trató con ácido fosfotungstato y cloruro de magnesio. Entonces, el LDL se precipitó de la fracción después de la centrifugación durante 2 min a 10.000 rpm. HDL, que permaneció en el sobrenadante, se realizó de acuerdo con la metodología de colesterol. La concentración de HDL es proporcional al color. El LDL se calculó restando el colesterol HDL del colesterol total.

Los triglicéridos séricos se hidrolizaron a glicerol y ácidos grasos libres mediante la lipoproteína lipasa. En presencia de adenosina trifosfato (ATP) y glicerol quinasa, se fosforiló el glicerol-3-fosfato, que se oxidó a acetona dihidrógeno fosfato y H2O2 por la glicerol fosfato oxidasa. El H2O2, la 4-aminoantipirina y el p-clorofenol sufrieron el mismo proceso de reacción informado anteriormente por peroxidasa en un baño de agua a 37 ºC durante 10 minutos hasta la formación de color rojo.

Para la prueba de glucosa en sangre, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa oxidó glucosa-6-fosfato en presencia de NADP en gluconato-6-fosfato. No se han oxidado otros carbohidratos. La tasa de formación de NADPH durante la reacción fue directamente proporcional a la concentración de glucosa, siendo determinada fotométricamente.

Análisis de estrés oxidativo La determinación de glutatión reducido (GSH) se realizó mediante la cuantificación de la base de tioles totales reducidos. Para esto, 150 μL de la sangre se agitaron con 100 μL de Triton X-100 al 10 % y 100 μL de TCA al 30 %, luego se centrifugaron durante 10 min a 4000 rpm. En la cubeta se pipetearon 900 µL de TFK 1 M, 50 µL de sobrenadante y 50 µL de DTNB 10 mM, que reaccionaron para formar un complejo amarillo. La lectura se tomó a 412 nm en un espectrofotómetro. Para el cálculo de la concentración se utilizó la curva de calibración con concentraciones de GSH predefinidas (0,005; 0,01; 0,025; 0,05; 0,1 mM).

Para evaluar la actividad de la enzima catalasa se utilizó, en base a la descomposición del H2O2 por la catalasa, monitoreada a 240 nm. Para ello, la sangre se diluyó 60 veces en TFK 50 mM. Se mezcló una alícuota de 20 μL con 1910 μL del mismo TFK y se añadieron 70 μL de H2O2, iniciando la reacción monitoreada durante tres minutos. Una constante de variación (κ) por minuto ayudó en la expresión de la enzima catalasa (κ/min).

Se utilizaron sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) como biomarcador de peroxidación lipídica. Se mezclaron alícuotas de plasma (150 µl) con 50 µl de NaOH y 50 µl de agua ultrapura Milli-Q (Direct 8, Millipore®) y se incubaron a 60 °C durante 30 minutos con agitación. Se añadieron a las muestras 250 µL de H₃PO₄ al 6 %, 250 µL de TBA al 0,8 % y 100 µL de SDS al 10 % y se llevaron al baño a 80 °C durante una hora. Los peróxidos lipídicos reaccionaron con TBA en medio ácido para formar un compuesto rosa y se leyeron en un espectrofotómetro a 532 nm. Para calcular la concentración de TBARS en plasma se realizó una curva de calibración de malondialdehído, principal sustancia reactiva del ácido tiobarbitúrico (0,28; 0,56; 1,7; 3,4; 6,6 µM).